COS7细胞冻存和复苏传代培养.ppt

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1、COS7细胞冻存和复苏传代培养 郭美琼 指导老师 陆家海 欧阳丽萍 研究目的 建立 CoS-7细胞培养的方法 观察 COS 7细胞培养的特点 了解 COS 7细胞的用途 建立 CoS-7细胞培养的方法 主要阐述 CoS-7细胞培养的体系 观察 COS 7细胞培养的特点 是贴壁细胞还是悬浮细胞？细胞培养过 程中形态的变化，分裂生长的形式等 了解 COS 7细胞的用途 COS-7细胞的来源、特性及生命医学用途： 小结 COS7细胞 (猴细胞的一种细胞系 )为重组病毒 的宿主细胞 ， 是表达 SV40大 T抗原的非洲绿 猴肾细胞株 ， 能支持部分突变型 SV40和含 SV40 ori的质粒载体的复制

2、 ,可高水平表达 外源基因 ， 常作为瞬时表达宿主 。 故本实验 建立 COS7细胞的冻存和复苏传代方法 。 （ 一 ） 实验材料 1 细胞株 cos7细胞株 2 试剂 RPMI-1640培养基 小牛血清（ NBS） N- (2-羟乙基 )-哌嗪 -Ng-2（丙磺顺酸） （ Hepes， Sigma公司产品）胰蛋白酶 碳 酸氢钠以及链霉素和青霉素 3 实验准备 1 培养液的配置 1 (1) RPMI-1640液： 1640粉 2袋 Hepes 2.14g碳酸氢钠 4.0g加水至 2000ml调至 PH=7.15，过滤。 1 (2) 1640完全培养液： 10小牛血清 双抗（含链霉素、青霉素）的

3、 1640培养液， 4 保存。 1 (3) 10%DMSO冻存液的配置： 1份 DMSO3 份小牛血清 6份完全培养基 1 (4) 胰蛋白酶 1.25gEDTA（乙二胺四乙 酸二钠） 0.10g于烧杯中先用少许 PBS调成 糊状，再补充 PBS至 500ml，搅拌混匀 4小时 后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。 2 Cos7细胞冻存方法 2 （ 1） 取对数生长期的细胞，收集细胞前换液 一次。 2 （ 2） Cos7细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成 细胞悬液， 1200转 /分离心 1分钟，去上清。弹指 法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴 加入与细胞悬液等量的 DMSO冻存液。 2 （

4、3） 分装：细胞悬液分装在 2 ml 冷冻管中， 密封后标记细胞名称和冷冻日期。 2 （ 4） 梯度降温冻存：冷冻管置 -20 、停留 1 2小时，再降至 70 过夜，投入液氮。 3 Cos7细胞复苏 3 （ 1） 将加有小牛血清双抗的 1640完全培 养液从冰箱取出，升至室温。 3 （ 2） 从液氮中取出冻存管，迅速投入 3738 水浴中，摇晃使其在 1分钟左右融化。 3 （ 3） 转至 EP管，加 1640完全培养液至 1.5 ml左右，吹打， 1200转 /min，离心 3分钟。 3 （ 4） 去上清，再加 1640完全培养液至 1.5 ml左右漂洗，离心 3分钟。去上清，加新鲜培 养液

5、吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液 至总体积约 4ml.，置温箱培养。 4 Cos7细胞传代 4 （ 1） 弃掉培养瓶内原来的培养液，加入 5 7滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶 底，吸出胰蛋白酶。 4 （ 2） 再加入 8 10滴 0.25%胰蛋白酶，将培 养瓶置 37 、 5 CO2孵箱 2 3min，观察细胞胞 体回缩变圆 ,细胞接近脱离瓶壁时终止消化。 4 （ 3） 小心吸出并弃去胰酶，加入 1 2ml1640完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细 胞悬液， 14 传代。各瓶加入培养液 2ml，放入 37 、 5 CO2培养箱继续培养。 二 结果 1 复苏细胞：第 1d,镜下观察

6、复苏细 胞悬浮于培养液中 ,折光性强 ,胞体呈圆 形 。 第 2d,复苏细胞镜下观察细胞大部分 贴壁 。 第 3d,复苏细胞镜下观察细胞增殖 速度较快 ， 折光性好 。 5d后可按比例传 代 。 2 传代细胞：第 1d,镜下观察传代细胞悬 浮于培养液中 ,折光性强 ,胞体呈圆形 。 第 2d,中 ,传代细胞镜下观察细胞已贴壁 , 折光性好 ,少数细胞出现伪足 。 第 3d,传 代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸 出伪足 ,细胞轮廓清楚 ,折光性强 ,细胞数 量明显增多 。 3 传代细胞传至第 6 8代仍保持增殖 状态，细胞生长速度未见减慢 ,能长满瓶 底。 三 讨论 1 养细胞维持传代以供实验

7、用常遇到某 些困难。首先，细胞株在传代中其性质 发生变化。其次，在传代中有微生物污 染的危险。解决这些困难的办法就是将 细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时 间几乎是无限的（因为在 -130 以下， 所有的生化反应已停止，而液氮的温度 在 -150 -160 之间） 2 培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培 养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度 过大，导致营养不良而引起细胞衰老 停止生长 甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须 进行稀释再培养，即将培养瓶内的细胞分离 稀 释 接种到新培养瓶内继续扩大培养。首次传代 的细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新环 境，以利于细胞的生存和增殖，通常原

8、代细胞 按 1： 2分种传代，细胞株按 1： 4分种传代 3 实验需严格遵守无菌操作规则 ， 以减 少操作引起的污染 。 一切操作 ， 都要在 火焰周围进行 ， 瓶口 、 吸管等要经过火 焰消毒 。 但用于吸取细胞培养液 、 小牛 血清 、 酶液的吸管使用后不能在火焰上 消毒 ， 因为残留在吸管中的培养液烧焦 炭化 ， 再使用时会把有害炭化物带入培 养液中毒害细胞 。 4 实验完毕 ， 关闭超净台鼓风机和电源 ， 未使用器材放入饭盒内 ， 用过的玻璃器 材投入清水中浸泡 ， 用酒精棉球擦拭工 作台面 。 可减少培养液被微生物污染 。 5 细胞冻存复苏的基本原则是慢冻速融 ,可最大限度 的保存细

9、胞活力 。 细胞直接冻存时 ,细胞内外的水分 会很快形成冰晶 ,引起一系列不良反应 。 因而在冻存 时尽可能地减少细胞内水分及冰晶形成 ,是保护细胞 减少损伤的关键 。 目前多采用甘油和二甲基亚砜 （ DMSO） 作保护剂 ,它们对细胞无明显毒性 ,分子量小 , 溶解度大 ,易穿透细胞 ,可以使冰点下降 。 通过缓慢冷 冻 ,使细胞内水分尽可能多的渗出细胞外 ,减少细胞内 冰晶形成 。 而复苏细胞时 ,采用快速融化 ,可保证细胞 外结晶在很短时间内融化 ,避免缓慢融化使水分渗入 细胞内形成细胞内再结晶 。 在本实验中 ,我们用二甲 基亚砜作保护剂 ,经过两个低温梯度 、 过夜后移入液 氮 ;融

10、化复苏时在 37 、 2分钟内完成 ,对细胞未造成 明显损伤 ,复苏后细胞存活率可达 90%,细胞形态 、 生 长速率与未冻存细胞相比 ,未见明显差异 6 cos7细胞生长分为 3期：延缓期 、 增殖期和 停滞期 .首次传代一般在 Cos7细胞增殖早期 ,此 时细胞刚刚度过延缓期 ,脆弱易损 ,首次传代对 于 Cos7细胞是否能长期存活尤为重要 .而在 Cos7细胞增殖后期 ,细胞贴壁紧密 ,消化时间不 足 ,细胞不易从瓶壁脱落 ,不仅传代细胞数量少 , 影响实验的准确性 ,而且由于局部代谢物的积 累 ,细胞即进入停滞期 ,若消化时间过长 ,待细 胞完全从瓶壁脱落 ,则细胞膜已受损 ,死细胞增

11、 多 .胰蛋白酶是常用的消化液 ,可使细胞脱离附 着物表面和相互离散成单个细胞 ,但胰蛋白酶 对细胞也有损伤可影响细胞活性 5.本文建议 采用 0.25%胰蛋白酶在 37 ,消化 2min的参数 。 这是因为在 37 下胰蛋白酶活性最大 ,所需消 化时间最短 ,可避免胰蛋白酶长时间作用于细 胞造成细胞的损失 。 7 本室探讨了 37 、 CO2条件为培养 Cos7细胞的适宜环境 。 因为刚复苏细胞 增殖缓慢 ,自身调节 pH的能力差的缘故 ， 显示复苏细胞要在 37 、 5 CO2条件下 培养才能顺利传代并保持较好的生长状 态 参考文献 1 Gluzman Y. SV40-transforme

12、d simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell,1981,23:175 182. 2 Sambrook J, Fristch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor, NY,1989 3 中山大学中山医学院分子医学研究中心 . 常用细胞生物学试验技术原理 .分子医学实验 技术培训班实验讲义 4 刘耳等 ， 中国畜禽传染病 ， 1989， 6， 45 5 马翠玲 ,李志强等 ,胰蛋白酶预处理在人角 质形成细胞传代培养中的应用 . 第四军医大学 学报 (JFourthMilMedUniv)2001;22(2)： 177