第二章细胞的破碎

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1、 第二章第二章 第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 第三节第三节 包涵体包涵体 细胞壁是微生物菌体比较复杂的结构。不仅取决于微细胞壁是微生物菌体比较复杂的结构。不仅取决于微生物的类型，还取决于培养发酵液的组成、细胞所处的生生物的类型，还取决于培养发酵液的组成、细胞所处的生长阶段、细胞的存储方式以及其它一些因素。不同微生物长阶段、细胞的存储方式以及其它一些因素。不同微生物菌体细胞壁的结构有一定差异。菌体细胞壁的结构有一定差异。一、细菌一、细菌 细菌的细胞壁坚韧而有弹性，由不同的肽链结合组成细菌的细胞壁坚韧而有弹性，由不同的肽链结合组成质量均

2、匀的网状结构，其厚度因细菌不同而有差异，可抵质量均匀的网状结构，其厚度因细菌不同而有差异，可抵御外界的机械损伤，并可承受细胞内强大的渗透压而不被御外界的机械损伤，并可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。破坏。细胞壁的主要成份是肽聚糖，由细胞壁的主要成份是肽聚糖，由N N乙酰葡糖胺（见图乙酰葡糖胺（见图2-1a2-1a）和）和N N乙酰胞壁酸（见图乙酰胞壁酸（见图2-1b2-1b）构成双糖单元，以）构成双糖单元，以（1-41-4）糖苷键连接成大分子。）糖苷键连接成大分子。N N乙酰胞壁酸分子上四肽乙酰胞壁酸分子上四肽侧链，相邻葡聚糖纤维之间的短肽通过肽桥或肽键连接起侧链，相邻葡聚糖纤维之间的短肽通

3、过肽桥或肽键连接起来，组成机械性很强的网状结构，像胶合板一样，粘合成来，组成机械性很强的网状结构，像胶合板一样，粘合成多层。各种细菌细胞壁酞聚糖结构均相同，但在四肽侧链多层。各种细菌细胞壁酞聚糖结构均相同，但在四肽侧链的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异。的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异。革兰氏阳性菌细胞壁（见图革兰氏阳性菌细胞壁（见图2-22-2）较厚，约）较厚，约202080nm80nm。含含15155050层肽聚糖片层，每层厚度层肽聚糖片层，每层厚度1nm1nm，约占细胞干重的，约占细胞干重的50%50%80%80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。图

4、图2-1 细菌细胞壁的主要组分细菌细胞壁的主要组分 革兰氏阴性菌细胞壁（见图革兰氏阴性菌细胞壁（见图2-32-3）细胞壁较薄，有）细胞壁较薄，有1 12 2层肽聚糖片，在肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层、脂多层肽聚糖片，在肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是将外膜固定于肽聚糖层，脂类糖三部分。脂蛋白的功能是将外膜固定于肽聚糖层，脂类和蛋白质等在稳定细胞结构上非常重要，如果被抽提，细和蛋白质等在稳定细胞结构上非常重要，如果被抽提，细胞壁将变得很不牢固。胞壁将变得很不牢固。二、真菌和酵母二、真菌和酵母 真菌的细胞壁含有几丁质（真菌的细胞壁含有几丁质（N-N-乙酰葡萄糖胺的一种

5、聚乙酰葡萄糖胺的一种聚合物）纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外还合物）纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外还有蛋白质、类脂、无机盐等。而酵母的细胞壁（见图有蛋白质、类脂、无机盐等。而酵母的细胞壁（见图2-42-4）由特殊的纤丝状物质构成，主要成份是甘露聚糖（由特殊的纤丝状物质构成，主要成份是甘露聚糖（31%31%），），葡聚糖（葡聚糖（29%29%），蛋白质（），蛋白质（13%13%）和类脂质（）和类脂质（8.5%8.5%）。酵母）。酵母中的葡聚糖的为中的葡聚糖的为 -1-1，6-6-葡聚糖通过葡聚糖通过-1-1，3 3键与键与D-D-葡萄糖葡萄糖中第一侧链交连而不溶于水。中第一

6、侧链交连而不溶于水。所有的真菌细胞壁是由不同的多糖链相互缠绕成一股所有的真菌细胞壁是由不同的多糖链相互缠绕成一股又粗又壮的链，嵌入在蛋白质及类脂和一些小分子的多糖又粗又壮的链，嵌入在蛋白质及类脂和一些小分子的多糖基质中，看起来像钢筋混凝土，从而解释了真菌细胞壁的基质中，看起来像钢筋混凝土，从而解释了真菌细胞壁的机械强度和硬度。机械强度和硬度。三、藻类三、藻类 藻类的细胞壁更为复杂，其主要结构成份，是纤丝状藻类的细胞壁更为复杂，其主要结构成份，是纤丝状的多糖类物质。的多糖类物质。M-甘露聚糠；P-磷酸二脂键；G-葡聚糠 图2-4 酵母细胞壁的结构示意图 细胞破碎的方法很多，在诸多破碎方法中，机械

7、法中细胞破碎的方法很多，在诸多破碎方法中，机械法中的球磨机和高压匀浆机不仅在实验室而且在工业得到应用。的球磨机和高压匀浆机不仅在实验室而且在工业得到应用。其它的方法大多尚停留在实验室应用，工业化的应用还在其它的方法大多尚停留在实验室应用，工业化的应用还在探索之中。探索之中。一、球磨法一、球磨法 球磨机是破碎微生物细胞的常用设备，一般有立式球磨机是破碎微生物细胞的常用设备，一般有立式（见图（见图2-52-5）或卧式（见图）或卧式（见图2-62-6）两种，在磨腔中装入小玻）两种，在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬

8、浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎。胞悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎。图2-5 Netzsch Molinex KE5搅拌磨 图2-6 Netzsh LM20砂磨机破碎作用遵循一级动力学定律：（2-1）式中 Rt时间内释放的蛋白质数量（mg/g）；Rm 1 0 0%破 碎 细 胞 释 放 的 蛋 白 质 数 量（mg/g）。k破碎的比速率，s-1；t球磨机工作的时间，s。()mdRk RRdt 将上式由开始工作到t时刻积分，可得：00RtdRktRmR1lnln()1mmRktRRx（2-2）式中 x为R/Rm，t时刻释放蛋白质的分数，x数值越大，表示破碎程度越高。一般用破碎率一般用

9、破碎率Y表示破碎程度。破碎率定义为被破碎表示破碎程度。破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞的百分数。细胞的数量占原始细胞的百分数。式中 N0原始细胞数量；N经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数量。N0和N可由直接计数法和间接法求得。直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计数法进行计数。数法进行计数。间接计数法是在细胞破碎后，将悬浮液离心分离，除去细间接计数法是在细胞破碎后，将悬浮液离心分离，除去细胞碎片，未破碎的细胞及其他悬浮物，然后对清液进行蛋白质胞碎片，未破碎的细胞及其他悬浮物，然后对清液进行蛋白质含量或酶的活性

10、进行分析。通过细胞释放出来的化合物的量含量或酶的活性进行分析。通过细胞释放出来的化合物的量R与所有细胞理论最大释放量与所有细胞理论最大释放量Rm的比值的比值R/Rm，求出破碎率。，求出破碎率。00%()100%YNNN （2-3）破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一。破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一。在用球磨法破碎细胞的过程中，影响因素有以下几个方在用球磨法破碎细胞的过程中，影响因素有以下几个方面：面：（1）搅拌器外缘速率）搅拌器外缘速率 搅拌器速度增加，剪切力增大，搅拌器速度增加，剪切力增大，细胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的热量产生和磨球细胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的热

11、量产生和磨球的磨损以及因剪切力引起产物失活，因此对于给定处理量和的磨损以及因剪切力引起产物失活，因此对于给定处理量和对蛋白质的释放要求下，存在着最佳效率点。实际生产中，对蛋白质的释放要求下，存在着最佳效率点。实际生产中，搅拌器外缘速率控制在（搅拌器外缘速率控制在（515）m/s之间。之间。（2）细胞的浓度）细胞的浓度 在细胞破碎过程中，产生的热量随浓在细胞破碎过程中，产生的热量随浓度的增大而提高，增加了冷却的费用。因此最佳的细胞浓度度的增大而提高，增加了冷却的费用。因此最佳的细胞浓度由实验来确定。用由实验来确定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或细菌时，研磨和破碎酵母或细菌时，细胞浓度控制

12、在细胞浓度控制在40%左右。左右。（3）球粒大小和装填量）球粒大小和装填量 磨球越小，细胞破碎速度越快。磨球越小，细胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中。因此实验室规模的但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中。因此实验室规模的研磨机中，球径为研磨机中，球径为0.2mm较好；而工业化规模操作中，球径较好；而工业化规模操作中，球径 0.4mm。且不同的细胞，应选择不同的球径。球粒的体积。且不同的细胞，应选择不同的球径。球粒的体积占研磨机腔体自由体积的百分比同样影响破碎效果，一般控占研磨机腔体自由体积的百分比同样影响破碎效果，一般控制在制在80%90%之间，并随球粒直径大小而变化。之间，并

13、随球粒直径大小而变化。（4 4）温度）温度 操作温度控制在操作温度控制在5 54040范围内对破碎范围内对破碎物影响不大。但在研磨过程中会产生热量积累，为控制磨物影响不大。但在研磨过程中会产生热量积累，为控制磨室温度，在搅拌器和磨室外筒分别设计有冷却夹套，通过室温度，在搅拌器和磨室外筒分别设计有冷却夹套，通过冷却剂来调节磨室的温度。冷却剂来调节磨室的温度。（5 5）流量）流量 高流量有利于降低能耗、降低细胞的破碎高流量有利于降低能耗、降低细胞的破碎程度和释放蛋白质的产量。程度和释放蛋白质的产量。（6 6）微生物特性）微生物特性 一般来说酵母比细菌细胞处理效果一般来说酵母比细菌细胞处理效果好。因

14、为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而且细菌细好。因为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而且细菌细胞的机械强度比酵母要高。一台胞的机械强度比酵母要高。一台20L20L球磨机在最适条件下，球磨机在最适条件下，每小时可加工每小时可加工200kg200kg面包酵母，而在同样条件下，处理细菌面包酵母，而在同样条件下，处理细菌细胞仅为细胞仅为101020kg20kg。二、高压匀浆法二、高压匀浆法 高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是高压匀浆机，它有一个高压位移泵和一个可调节进设备是高压匀浆机，它有一个高压位移泵和一个可调节进料速度的针形阀（见图料

15、速度的针形阀（见图2-72-7）。当菌体悬浮液经过高压泵加）。当菌体悬浮液经过高压泵加压后，通过阀芯与阀座之间的通道时，悬浮液突然改变方压后，通过阀芯与阀座之间的通道时，悬浮液突然改变方向，向球撞击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时向，向球撞击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时产生巨大的冲击力，将细胞破碎，然后排出。其破碎率服产生巨大的冲击力，将细胞破碎，然后排出。其破碎率服从一级反应定律。从一级反应定律。dmnmRlkNPRR （2-4）式中式中R为蛋白质释放量；为蛋白质释放量；Rm为蛋白质最大释放量；为蛋白质最大释放量；N为悬为悬浮液通过匀浆器的次数；浮液通过匀浆器的次数；P为操作

16、压力；为操作压力；k为与温度有关的速为与温度有关的速度常数；指数度常数；指数d值对于有机体是抵抗破碎能力的一种量度，不值对于有机体是抵抗破碎能力的一种量度，不同的有机体其值不同，如酿酒酵母同的有机体其值不同，如酿酒酵母d=2.9，大肠杆菌，大肠杆菌d=2.21。在高压匀浆机操作中，主要影响因素有：在高压匀浆机操作中，主要影响因素有：图图2-7 高压匀浆机的排出阀装置高压匀浆机的排出阀装置图图 （1）温度 破碎率随着温度的升高而增加。当悬浮液中酵母浓度（450750）kg/m3，操作温度由5提高到30时，破碎率约提高1.5倍。但是高温破碎只适用于非热变性产物，如果温度高于40时，蛋白质在破碎过程

17、中会发生变性。因此，进口处用干冰来调节温度，使出口处的温度维持在20左右。（2）压力 操作压力的合理选择非常重要。提高压力需增加消耗，压力每升高100Mpa会多消耗3.5KW能量；压力每升高10Mpa，温度将提高2；另外压力过高将引起高压匀浆机排出阀座剧烈磨损。通常非结合的酶，操作压力为5.45107Pa，菌体浓度10%20%（质量分数），处理一次即可。在操作压力为55Mpa的条件下，通过6次匀浆假丝酵母得到30%可利用蛋白质。一般来讲，高压匀浆机最适合于酵母和细菌。一般来讲，高压匀浆机最适合于酵母和细菌。三、超声破碎法三、超声破碎法 超声破碎法是另一种液相剪切破碎法。其实验室装置见图2-8。

18、图图2-8 连续破碎池的结构简图连续破碎池的结构简图 当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。在超声波破碎过程中，蛋白质释放遵循一级反应定律：1exp()xkt （2-5）式中 x为释放蛋白质的分率；k为蛋白质释放常数,min-1；t为超声波发射时间，min。蛋白质释放常数k取决于输入声能，由实验确定。对于从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液)，用190声瓦的20HZ声频的超声波处理时：k=b(P-P0)0.9 （2-6）式中 b为常数；P为输入功率，J/(kg.s)；P0为由超声波引起的空穴的临界功率，J/(kg.s)。当超

19、声波声能通过探头向悬浮液传递能量，当产生的气泡破裂时，绝大部分释放出的能量都以热的形式为液体吸收，为避免高温，在破碎池中设计了冷却水夹套，并在开始时先把悬浮液冷却至05，并不断将冷却液连续通过夹套，短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作，以防止高温使蛋白质变性。为提高破碎效率，在破碎池中可添加细小的球粒（可以是钢制的或玻璃的），以产生“研磨”效应，提高细胞破碎率。超声波破碎是实验室常用的一种普通方法，由于向大量超声波破碎是实验室常用的一种普通方法，由于向大量的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难，因此在工业还未的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难，因此在工业还未采用。采用。四、酶溶法四、酶溶法

20、酶溶法是利用细胞壁水解酶使细胞壁溶解，释放出胞内酶溶法是利用细胞壁水解酶使细胞壁溶解，释放出胞内物质的方法。根据菌体不同的细胞壁结构选用特定的溶解酶。物质的方法。根据菌体不同的细胞壁结构选用特定的溶解酶。细胞壁溶解酶有内细胞壁溶解酶有内-N-乙酰壁酰胺酶和内乙酰壁酰胺酶和内-N-乙酰氨基葡乙酰氨基葡萄糖苷酶，水解萄糖苷酶，水解N-乙酰壁酸与乙酰壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的乙酰氨基葡萄糖之间的-1,4键；键；N-乙酰壁酸乙酰壁酸-L-丙氨酸酰胺酶系切开肽聚糖与肽之间丙氨酸酰胺酶系切开肽聚糖与肽之间结合点的酶，又称自溶素，在微生物细胞的自溶上起着重要结合点的酶，又称自溶素，在微生物细胞的自溶上起

21、着重要的作用。酞酶切开肽聚糖中肽段部分的肽键，单独存在时有的作用。酞酶切开肽聚糖中肽段部分的肽键，单独存在时有一定的溶菌作用，而在有葡聚糖酶共存时有明显可促进真菌一定的溶菌作用，而在有葡聚糖酶共存时有明显可促进真菌细胞壁的溶解。针对细菌细胞壁的结构和组成，使用酶溶解细胞壁的溶解。针对细菌细胞壁的结构和组成，使用酶溶解细菌细胞壁时，通常选用两种以上的酶协同作用，使溶解作细菌细胞壁时，通常选用两种以上的酶协同作用，使溶解作用增强。用增强。酵母细胞壁溶解酶主要成份是酵母细胞壁溶解酶主要成份是-1,3葡聚糖酶，当它与葡聚糖酶，当它与磷酸甘露聚糖酶、蛋白酶同时作用时，对溶解酵母的作用磷酸甘露聚糖酶、蛋白

22、酶同时作用时，对溶解酵母的作用显著增强。而显著增强。而-1,3葡聚糖酶与甲壳质酶协同作用时可溶解葡聚糖酶与甲壳质酶协同作用时可溶解由甲壳质和葡聚糖构成的霉菌细胞壁。由甲壳质和葡聚糖构成的霉菌细胞壁。酶溶法的优点有：酶溶法的优点有：对设备的要求低，能耗小；对设备的要求低，能耗小；抽抽提的速率和收率高；提的速率和收率高；产品的完整性好；产品的完整性好；对对pH值和温度值和温度等外界条件要求低；等外界条件要求低；由于细胞壁被溶解，不残留碎片，由于细胞壁被溶解，不残留碎片，有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。五、化学渗透法五、化学渗透法 用某些化学试剂溶解细胞壁

23、或抽提细胞中某些组分的方用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法称为化学渗透法。例如在发酵液中添加酸碱、脂溶性有机法称为化学渗透法。例如在发酵液中添加酸碱、脂溶性有机溶剂（甲苯、丁醇、丙酮、氯仿等）和某些表面活性剂，改溶剂（甲苯、丁醇、丙酮、氯仿等）和某些表面活性剂，改变菌体细胞壁或膜的通透性，使细胞壁破裂，使胞内物质释变菌体细胞壁或膜的通透性，使细胞壁破裂，使胞内物质释放出来。放出来。酸碱用来调节溶液的酸碱用来调节溶液的pH值，改变细胞所处的环境，从而值，改变细胞所处的环境，从而改变两性产物蛋白质的电荷改变两性产物蛋白质的电荷性质，使蛋白质和蛋白质之间性质，使蛋白质和蛋白质之间或蛋

24、白质与其他物质之间的作用力降低而溶解到液相中去，或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而溶解到液相中去，便于后面的提取。便于后面的提取。有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把胞内产物释放到水相中去。选用溶剂的基本原则是破裂，把胞内产物释放到水相中去。选用溶剂的基本原则是与细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶与细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂剂。表面活性剂是指不仅能溶于水或其他有机溶剂，同时又能在相界表面活性剂是指不仅能溶于水或其他有机溶剂，同时又能在相界面上定向并改变界面的性质的某些有机化合物。

25、表面活性剂分子中间面上定向并改变界面的性质的某些有机化合物。表面活性剂分子中间同时具有憎水基团和亲水基团，当表面活性剂溶质或溶剂中的浓度达同时具有憎水基团和亲水基团，当表面活性剂溶质或溶剂中的浓度达到一定时，它的分子会产生聚集生成胶束，憎水端向内，亲水端向外。到一定时，它的分子会产生聚集生成胶束，憎水端向内，亲水端向外。憎水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向憎水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向外层，使膜的通透性改变或使细胞壁溶解，从而使胞内物质释放到水外层，使膜的通透性改变或使细胞壁溶解，从而使胞内物质释放到水相中。此法特别适用于膜结合蛋白酶的溶解

26、。表面活性剂按分子结构相中。此法特别适用于膜结合蛋白酶的溶解。表面活性剂按分子结构中带电性的特征可分为：阴离子型（如直链烷基苯磺酸盐），亲水基中带电性的特征可分为：阴离子型（如直链烷基苯磺酸盐），亲水基团带有负电荷；非离子型，如碳原子数在团带有负电荷；非离子型，如碳原子数在12以上的高碳脂肪醇，在分以上的高碳脂肪醇，在分子中没有带电荷的基团，其水溶性来自于分子中所具有的聚氧乙烯醚子中没有带电荷的基团，其水溶性来自于分子中所具有的聚氧乙烯醚基和端点羟基；阳离子表面活性剂，亲水基团带有正电荷；两性表面基和端点羟基；阳离子表面活性剂，亲水基团带有正电荷；两性表面活性剂，在水中同时具有可溶于水中的正电

27、性和负电性基团。一般来活性剂，在水中同时具有可溶于水中的正电性和负电性基团。一般来说，使用离子型表面活性剂比非离子型提取效果要好一些。说，使用离子型表面活性剂比非离子型提取效果要好一些。六、其它方法六、其它方法 除上述各种方法外，常用的方法还有以下几种。除上述各种方法外，常用的方法还有以下几种。（1）反复冻融法）反复冻融法 将待破碎细胞在将待破碎细胞在15至至20条件条件下冷冻，然后在室温下融化，冷冻时膜的疏水键被破碎而疏下冷冻，然后在室温下融化，冷冻时膜的疏水键被破碎而疏水性增强，胞内水形成冰晶粒而使细胞内盐分浓度加大，反水性增强，胞内水形成冰晶粒而使细胞内盐分浓度加大，反复冻融多次，使细胞

28、破裂将胞内物质释放出来。复冻融多次，使细胞破裂将胞内物质释放出来。（2）干燥法）干燥法 将待破碎细胞用不同方法进行干燥，菌体细将待破碎细胞用不同方法进行干燥，菌体细胞失水，细胞内盐分浓度增大，细胞渗透性发生变化，然后胞失水，细胞内盐分浓度增大，细胞渗透性发生变化，然后用丙酮，乙醇或缓冲溶液等溶剂抽提胞内物质。干燥的方法用丙酮，乙醇或缓冲溶液等溶剂抽提胞内物质。干燥的方法有空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等。对不稳定生化物质进有空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等。对不稳定生化物质进行干燥时，常加入半胱胺酸，巯基乙醇和亚硫酸钠等还原剂行干燥时，常加入半胱胺酸，巯基乙醇和亚硫酸钠等还原剂进行保护。进行保护。

29、（3 3）渗透压冲击法）渗透压冲击法 将两种不同成分或不同浓度的溶将两种不同成分或不同浓度的溶液，中间用半透膜隔开，则两种溶液因性质不同可由一方液，中间用半透膜隔开，则两种溶液因性质不同可由一方向另一方渗透，这种现象叫渗透现象，其推动力是渗透压。向另一方渗透，这种现象叫渗透现象，其推动力是渗透压。菌体细胞膜是天然半透膜，把待破碎细胞经一定浓度甘油菌体细胞膜是天然半透膜，把待破碎细胞经一定浓度甘油或蔗糖溶液处理，在高渗压溶液中细胞脱水，细胞质变稠，或蔗糖溶液处理，在高渗压溶液中细胞脱水，细胞质变稠，发生质壁分离。然后转入低渗透压溶液中或缓冲溶液中，发生质壁分离。然后转入低渗透压溶液中或缓冲溶液中

30、，细胞快速吸水膨胀而破裂，使胞内物释放到溶液中。用此细胞快速吸水膨胀而破裂，使胞内物释放到溶液中。用此法处理大肠杆菌时，可使磷酸脂酶、核糖核酸酶和脱氧核法处理大肠杆菌时，可使磷酸脂酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶等释放至溶液中。蛋白质释放量一般为菌体蛋白糖核酸酶等释放至溶液中。蛋白质释放量一般为菌体蛋白总量的总量的4%4%7%7%。但此法对革兰氏阳性菌不适用。但此法对革兰氏阳性菌不适用。（4 4）冷热交替法）冷热交替法 将待破碎细胞在将待破碎细胞在9090维持数分钟，立即放入冰水维持数分钟，立即放入冰水浴使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。从细菌或病毒浴使之冷却，如此反复多次，绝大部

31、分细胞可以被破碎。从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。中提取蛋白质和核酸时可用此法。无论是运用机械法还是非机械法都要既能破坏微生物菌体的细胞壁，无论是运用机械法还是非机械法都要既能破坏微生物菌体的细胞壁，又要得到不发生变性的蛋白产物。因此，选择合理的破碎方法非常重要，又要得到不发生变性的蛋白产物。因此，选择合理的破碎方法非常重要，通常选择破碎方法遵循以下一般原则：通常选择破碎方法遵循以下一般原则：提取的产物在细胞质内，选用机械破碎法；提取的产物在细胞质内，选用机械破碎法；在细胞膜附近则可用温和的非机械法；在细胞膜附近则可用温和的非机械法；提取的产物与细胞壁或膜相结合时，可采用机械法和化学

32、法相结提取的产物与细胞壁或膜相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件；合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件；为提高破碎率，可采用机械法和非机械法相结合的方法。如面包为提高破碎率，可采用机械法和非机械法相结合的方法。如面包酵母的破碎，可先用细胞壁溶解酶予处理，然后用高压匀浆机在酵母的破碎，可先用细胞壁溶解酶予处理，然后用高压匀浆机在95Mpa95Mpa压力下匀浆四次，总破碎率可接近压力下匀浆四次，总破碎率可接近100%100%，而单独用高压匀浆机破碎率只，而单独用高压匀浆机破碎率只有有32%32%。利用利用DNADNA重组技术，把重组体重组技术，

33、把重组体DNADNA引入宿主细胞，使其在引入宿主细胞，使其在细胞内表达，便可得到一定的蛋白质。目前已成功的利用大细胞内表达，便可得到一定的蛋白质。目前已成功的利用大肠杆菌发酵生产胰岛素，人的生长激素，人胸腺激素肠杆菌发酵生产胰岛素，人的生长激素，人胸腺激素1 1，、干扰素，牛生长激素，乙型肝炎病毒抗原和口啼干扰素，牛生长激素，乙型肝炎病毒抗原和口啼疫病毒抗原等。外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包疫病毒抗原等。外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成。所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的涵体的形成。所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体

34、，其中大部杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。这些目标产物蛋白在一级结分是克隆表达的目标产物蛋白。这些目标产物蛋白在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物活性。在利用大肠杆菌生产蛋白的过程中，重组蛋白大多数活性。在利用大肠杆菌生产蛋白的过程中，重组蛋白大多数情况是以包涵体形式存在。要从包涵体中分离出具有生物活情况是以包涵体形式存在。要从包涵体中分离出具有生物活性的产物，通常的处理步骤为：收集菌体细胞性的产物，通常的处理步骤为：收集菌体细胞细胞破碎细胞破碎离心分离离心分离包涵体的洗

35、涤包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的变性溶解目标蛋白目标蛋白的复性。的复性。一、包涵体的形成、分离及洗涤一、包涵体的形成、分离及洗涤 形成包涵体的因素主要有以下几个方面：形成包涵体的因素主要有以下几个方面：重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来；白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来；由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小；能正确配对，导致重组蛋白溶解

36、度变小；与重组蛋白的氨基酸组成有关，一般说含硫氨基酸越高越易形成与重组蛋白的氨基酸组成有关，一般说含硫氨基酸越高越易形成包涵体；包涵体；重组蛋白是宿主菌的异源蛋白，大量生成后，缺乏后修饰所需酶重组蛋白是宿主菌的异源蛋白，大量生成后，缺乏后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀；类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀；与重组蛋白的本身的溶解性有关；与重组蛋白的本身的溶解性有关；在细菌分泌的某个阶段，蛋白质间的离子键、疏水键或共价键等在细菌分泌的某个阶段，蛋白质间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体形成。化学作用导致了包涵体形成。

37、由于重组蛋白形成包涵体，包涵体又位于细胞质中，因由于重组蛋白形成包涵体，包涵体又位于细胞质中，因此可选择破碎细胞的方法，得到包涵体。例如人此可选择破碎细胞的方法，得到包涵体。例如人干扰素干扰素的提取中，先把发酵液冷却至的提取中，先把发酵液冷却至1010以下，离心（以下，离心（4000r/min4000r/min）分离，除去上层清液，得到菌体，将细胞悬浮于分离，除去上层清液，得到菌体，将细胞悬浮于1010倍体积倍体积PBSPBS缓冲溶液中，于冰浴下进行超声破碎，反复缓冲溶液中，于冰浴下进行超声破碎，反复5 5次，每次次，每次5s5s，离心（离心（4000r/min4000r/min）分离后，用）

38、分离后，用0.1%TritonX-1000.1%TritonX-100的溶液充分的溶液充分搅拌均匀，进行洗涤。洗涤三次后，离心（搅拌均匀，进行洗涤。洗涤三次后，离心（10000r/min2010000r/min20分分钟），可得到包涵体。细胞破碎后离心分离的包涵体沉淀物钟），可得到包涵体。细胞破碎后离心分离的包涵体沉淀物中，除目标蛋白质外，还有其他蛋白质、核酸等的存在，经中，除目标蛋白质外，还有其他蛋白质、核酸等的存在，经过洗涤，可以除去吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白、膜碎过洗涤，可以除去吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白、膜碎片等，达到纯化包涵体的目的。洗涤多采用较温和的表面活片等，达到纯化包涵

39、体的目的。洗涤多采用较温和的表面活性剂（如性剂（如TritonX-100TritonX-100）或低浓度的弱变性剂（如尿素）等。）或低浓度的弱变性剂（如尿素）等。洗涤剂的浓度非常重要，通常不要太高，以免包涵体也发生洗涤剂的浓度非常重要，通常不要太高，以免包涵体也发生溶解。溶解。二、包涵体的变性溶解二、包涵体的变性溶解 包涵体中不溶性的活性蛋白产物必须溶解到液相中，才包涵体中不溶性的活性蛋白产物必须溶解到液相中，才能采用各种手段使其得到进一步纯化。一般的水溶液很难将能采用各种手段使其得到进一步纯化。一般的水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性的方法才能使其形成可溶性的其溶解，只有采用蛋白质变性的

40、方法才能使其形成可溶性的形式。常用的变性增溶剂有十二烷磺酸钠（形式。常用的变性增溶剂有十二烷磺酸钠（SDSSDS）、尿素、）、尿素、有机溶剂（乙腈、丙酮）、有机溶剂（乙腈、丙酮）、pHpH9.09.0的碱溶液或盐酸胍等。的碱溶液或盐酸胍等。十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）是曾经广泛使用的变性剂。它）是曾经广泛使用的变性剂。它可在低浓度下溶解包涵体，主要是破坏蛋白质肽链间的疏水可在低浓度下溶解包涵体，主要是破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。但是结合在蛋白质上的相互作用。但是结合在蛋白质上的SDSSDS分子难以除去。一般分子难以除去。一般SDSSDS的使用浓度为的使用浓度为1%1%2%

41、2%（w/vw/v）。）。尿素和盐酸胍可打断包涵体内的化学键和氢键。用（尿素和盐酸胍可打断包涵体内的化学键和氢键。用（8 81010）mol/L mol/L 的尿素溶解包涵体，其溶解速度较慢，溶解度为的尿素溶解包涵体，其溶解速度较慢，溶解度为70%70%90%90%。在复性后除去尿素不会造成蛋白质的严重损失，同。在复性后除去尿素不会造成蛋白质的严重损失，同时还可选用多种层析方法对提取到的包涵体进行纯化。但用尿时还可选用多种层析方法对提取到的包涵体进行纯化。但用尿素溶解对蛋白质很难恢复活性。盐酸胍对包涵体的溶解效率很素溶解对蛋白质很难恢复活性。盐酸胍对包涵体的溶解效率很高，达高，达95%95%以

42、上，溶解速度快。缺点在于成本较高，且除去盐以上，溶解速度快。缺点在于成本较高，且除去盐酸胍时，蛋白质会有较大的损失，而且盐酸胍对后期离子交换酸胍时，蛋白质会有较大的损失，而且盐酸胍对后期离子交换提纯有干扰作用。提纯有干扰作用。对于含有半胱氨酸的蛋白质，其包涵体形式通常含有链间对于含有半胱氨酸的蛋白质，其包涵体形式通常含有链间形成错配的无活性的二硫键，因此还要加入还原剂使二硫键处形成错配的无活性的二硫键，因此还要加入还原剂使二硫键处于可逆断裂状态。常用的还原剂有二巯基乙醇（于可逆断裂状态。常用的还原剂有二巯基乙醇（2-ME2-ME）、二）、二硫硫基苏糖醇（基苏糖醇（DTTDTT）、二硫赤藓糖醇、

43、半胱胺酸等。对于目标蛋）、二硫赤藓糖醇、半胱胺酸等。对于目标蛋白无二硫键的包涵体加入还原剂也有增溶作用，可能是含有二白无二硫键的包涵体加入还原剂也有增溶作用，可能是含有二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。三、蛋白质的复性三、蛋白质的复性 由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物活性，加上剧烈的处理条件，使由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白质的高级结构破坏，因此蛋白质的复性特别重要。所谓复性是指变蛋白质的高级结构破坏，因此蛋白质的复性特别重要。所谓复性是指变性的包涵体蛋白质在适当条件下使伸展的肽键形成特定三维结构，使无性的包涵体蛋白质在适当条件下使

44、伸展的肽键形成特定三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。其操作方法是用透析法活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。其操作方法是用透析法或超滤法，缓慢除去变性液中多余的变性剂和还原剂，使伸展的肽链恢或超滤法，缓慢除去变性液中多余的变性剂和还原剂，使伸展的肽链恢复到正常折叠状态，错误的二硫键进行正常链接。也可采用稀释复性的复到正常折叠状态，错误的二硫键进行正常链接。也可采用稀释复性的方法，直接加入水或与变性液相同的、不含还原剂的缓冲溶液，改变蛋方法，直接加入水或与变性液相同的、不含还原剂的缓冲溶液，改变蛋白质分子周围溶剂的性质，促进肽链正常折叠和二硫键重新组合。人白质分子周围

45、溶剂的性质，促进肽链正常折叠和二硫键重新组合。人-干扰素的复性操作中，就是将变性溶液用干扰素的复性操作中，就是将变性溶液用50mmol/L50mmol/L的的Tris-HClTris-HCl缓冲缓冲溶液稀释溶液稀释100100倍，使尿素浓度小于倍，使尿素浓度小于0.1mol/L,0.1mol/L,在在44下搅拌下搅拌2424小时，即可小时，即可完成蛋白质的重折叠过程。完成蛋白质的重折叠过程。复性过程是一个十分复杂的过程，迄今为止包涵体形成和复性过程复性过程是一个十分复杂的过程，迄今为止包涵体形成和复性过程中发生聚集的机理尚不清楚，已建立的高效复性方法是在反复实验和优中发生聚集的机理尚不清楚，已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，因此具体操作中要不断探索最适用的条件。化的基础上建立的，因此具体操作中要不断探索最适用的条件。