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1、MDCK细胞培养 技术肖敏2009.12.242009.12.24ContentsMDCK细胞复苏MDCK细胞传代MDCK细胞冻存培养基与培养条件v细胞培养液：90 MEM+10FBS+1PSv冻存液：90FBS+10DMSOv培养箱温度：37v二氧化碳浓度：5MDCK细胞的复苏v仪器和耗材：温水温水（37 40 ）温度计温度计 废液缸废液缸 培养液培养液 吸量管吸量管 移液器移液器 离心管（离心管（15mL）细胞培养瓶细胞培养瓶v步骤：在资料库中找出所要细胞的位置，并更改好资料。从-196 液氮中取出细胞管，投入温水中，尽快使其溶解，加入适量的培养液稀释，离心，去上清，敲散细胞，加入培养液于
2、培养瓶中，置于37，5%CO2培养箱中培养。注意事项：v液氮温度极低，在使用过程中要做好防护（戴棉手套、不穿露趾鞋等），防止冻伤。v在液氮中操作时速度要快，要注意轻拿轻放，以免内容物解冻，造成不必要的损失。v 在使用液氮时，要保持通风良好，以避免空间缺氧，造成窒息。v因DMSO在常温下对细胞有毒性，解冻后要尽快稀释。MDCK细胞的传代v仪器和耗材：培养液 0.25的胰酶 PBS 离心管 细胞培养瓶 吸量管 移液器 废液缸 步骤：v1.镜下观察细胞生长情况，密度等，以决定消化的时间。v2.用PBS洗两次，PBS要打在细胞瓶侧壁，以免直接冲洗细胞造成细胞损伤，液体易残留在细胞瓶口，造成污染，要加以
3、注意。v3.加入胰酶，胰酶的量是随细胞的生长密度而定，一定量的胰酶消化一定量的细胞，一般情况下，75T细胞瓶加入4mL胰酶，25T细胞瓶加入2mL胰酶，以胰酶能覆盖整个瓶底为准。v4.因胰酶最佳消化温度是37，可把细胞瓶放入培养箱中，定时镜下观察，当细胞收缩、变圆、单个分开时可终止消化，轻轻敲打细胞瓶使细胞脱落，加入等量的培养液中和。v5.吹吸混匀细胞，把液体转移至15ML离心管中，5分钟，800转离心下细胞。v6.小心弃去上清，轻轻敲打在离心管底部的细胞，加入培养液稀释重悬，稀释的倍数根据细胞生长的密度与传代时间决定，也可通过细胞计数而定。最后把细胞置于细胞培养瓶中培养。培养液的量一般是75
4、T细胞瓶加入10mL培养液，25T细胞瓶加5mL培养液。v7.轻摇细胞瓶，使细胞均匀平铺于细胞瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。每日观察其生长情况。MDCKMDCK细胞冻存v仪器与耗材 FBS DMSO 培养液 PBS 0.25的胰酶 冻存管 封口膜 程序降温盒 吸量管 移液器 废液缸v 冻存的细胞密度较稀，取对数生长期细胞，大概7080满瓶就可冻存，冻存的量根据密度而定，一般70 80满瓶的一瓶75T细胞可冻存5管左右。v步骤：(前面步骤与细胞传代相同）细胞消化下来后，倒掉上清，把细胞敲散，加入事先配好的冻存液（90FBS+10DMSO），充分混匀，分装成1mL/管，并在管上标上细胞名称、代数
5、、冻存日期与操作者，封上封口膜，放入程序降温盒中，把程序降温盒整个放入80 冰箱，过夜后放入196 液氮罐中长期保存。v注意事项：由于DMSO稀释时会释放大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞中，必须使用前先行配制。DMSO在常温下对细胞有毒性，特别是在大批量冻存的时候，可先把配好的冻存液放入冰水中降温，同样，程序降温盒也可先放入 4 冰箱中预温。如果没有程序降温盒的情况下，可采用逐步降温来冻存（4半个小时20半个小时80 16-18（或过夜)液氮长期保存）霉菌污染霉菌污染 CPEv细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法，一般利用计数板（血球计数板）进行。计数前须制备分散的细胞悬液。v1.制备细胞悬液v步骤与细胞传代相同，把细胞消化之后，加入一定量的培养液（或PBS），吹吸混匀使细胞脱壁制成细胞悬液2.计数在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片充分混匀细胞悬液，用吸管吸取细胞，让吸管在盖玻片上或下侧的计数板处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。置显微镜下计数四个大方格内的细胞总数，对于压线的细胞只计数在上线和左线者，细胞团按单个细胞计数。细胞密度=（四个大格细胞总数4）104稀释倍数
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