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1、实验八实验八 PCR产品纯化及定向克隆产品纯化及定向克隆一、实验目的一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的DNA纯化和连接方法；巩固纯化和连接方法；巩固DNA酶切的操作。酶切的操作。二、实验原理二、实验原理 PCR产物一般都含有过量的引物、产物一般都含有过量的引物、Taq酶及酶及dNTP等成分，直接影响后续的基因操作，利用苯酚等成分，直接影响后续的基因操作，利用苯酚/氯仿、氯仿、氯仿依次抽提反应体系中的酶，然后在酸性条件下用氯仿依次抽提反应体系中的酶，然后在酸性条件下用乙醇沉淀乙醇沉淀DNA。根据实验六所用的根据实验六所用的PCR引物，其产品的引
2、物，其产品的5和和3末端末端分别具有分别具有EcoR I和和Not I酶切位点，而载体酶切位点，而载体pET32的多的多克隆位点中也有此两个酶切位点。因此，若将克隆位点中也有此两个酶切位点。因此，若将PCR产产物与载体分别用物与载体分别用EcoR I和和Not I进行双酶切，所得的产进行双酶切，所得的产物相应末端正好互补，可用物相应末端正好互补，可用T4 DNA连接酶在体外进行连接酶在体外进行连接。连接。正向引物（正向引物（P1）EcoRI 5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3反向引物（反向引物（P2）：）：Not I 5-AGAGCGGCCGCCTTT
3、GCCATCATAACTTTGACAAA-3三、实验材料与主要试剂三、实验材料与主要试剂1、实验材料、实验材料 实验二提取的质粒载体实验二提取的质粒载体pET32 实验七的实验七的PCR产品以及实验八的产品以及实验八的RT-PCR产品产品2、主要试剂、主要试剂 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：EcoR I和和Not I T4 DNA连接酶连接酶 苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、）、无水乙醇、无水乙醇、70%乙醇等乙醇等四、实验步骤四、实验步骤1、PCR产品的纯化产品的纯化 每组同学的每组同学的PCR和和RT-PCR产品合并，约产品合并，约130l
4、，转，转入入1.5ml离心管中，向离心管中，向PCR产品中加入产品中加入150l苯酚苯酚/氯氯仿仿/异戊醇，旋涡混合，异戊醇，旋涡混合，14000 rpm离心离心5 min；将上层水相转移至新离心管，加入将上层水相转移至新离心管，加入150l氯仿，旋涡氯仿，旋涡混合，混合，14000 rpm离心离心5 min；再将上层水相转移至新离心管，加再将上层水相转移至新离心管，加10l醋酸钠和醋酸钠和250l无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置 30 min；在在4下下14000 rpm离心离心10 min，去除上清，观察，去除上清，观察DNA沉淀。沉淀。加加20l灭
5、菌水溶解灭菌水溶解DNA，备用。，备用。四、实验步骤四、实验步骤2、PCR产品与载体产品与载体pET32的双酶切的双酶切 分别在两个分别在两个1.5mL离心管中准备双酶切反应混合液。离心管中准备双酶切反应混合液。A.10 H buffer 5l B.10 H buffer 5l 0.1%BSA 5l 0.1%BSA 5l EcoR 2l EcoR 2l Not 2l Not 2l PCR产品产品 20l pET32载体载体 约约2g 灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水 16l 加灭菌蒸馏水至总体积加灭菌蒸馏水至总体积50l 将上述两个离心管内的混合物轻轻混匀，将上述两个离心管内的混合物轻轻混匀，37水浴酶切
6、水浴酶切3小时。小时。四、实验步骤四、实验步骤3、酶切产品的纯化、酶切产品的纯化 酶切后的酶切后的PCR产品和载体合并产品和载体合并(约约100l)，加入，加入100l苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇，旋涡混合，异戊醇，旋涡混合，14000 rpm离心离心5 min；将上层水相转移至新离心管，加入将上层水相转移至新离心管，加入100l氯仿，旋涡混合，氯仿，旋涡混合，14000 rpm离心离心5 min；再将上层水相转移至新离心管，加再将上层水相转移至新离心管，加10l醋酸钠和醋酸钠和250l无水无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置 30 min；在在4下下14000
7、rpm离心离心10 min，去除上清；，去除上清；加入加入500l 70%乙醇洗涤乙醇洗涤DNA沉淀，在沉淀，在4下下14000 rpm离离心心5min，去除上清，空气干燥；，去除上清，空气干燥；加加8l灭菌水溶解灭菌水溶解DNA，备用。，备用。四、实验步骤四、实验步骤 4、目的基因、目的基因(CaM5)与载体与载体(pET32)的连接的连接 在灭菌的在灭菌的PCR管中依次加入：管中依次加入：10 T4 DNA Ligase buffer 1l T4 DNA Ligase 1l PCR产品和产品和pET32 8l 将混合物轻轻混匀，将混合物轻轻混匀，16连接过夜。连接过夜。第二天，从第二天，从PCR仪中取出连接产物，置于仪中取出连接产物，置于-80保存到下次实验使用保存到下次实验使用。五、实验结果五、实验结果 本实验结果必须通过观察转化后所得菌落的多少来本实验结果必须通过观察转化后所得菌落的多少来判断连接的效率。判断连接的效率。
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