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1、首都师范大学生物实验报告科目：细胞生物学 班级：师范班 姓名：王攀 学号：1110800065实验名称：植物细胞的胞吞作用和内膜系统的荧光显微观察日期：10.30一、实验目的1、了解植物细胞的胞吞作用和内膜系统2、学会使用荧光显微镜二、实验原理1、植物细胞的吞排作用：细胞伸长生长所需要的物质分别在内质网（如蛋白质、脂类）和高 尔基体（细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素）合成，运输小泡 胞吐作用分泌至胞外 或质膜上，促进新的细胞膜和细胞壁的生长；另一方面，在细胞扩展增长过程中一些过 剩的蛋白质、多糖、细胞壁前体物质等细胞成分，需要通过胞吞作用重新回到胞质中使 之得以及时回收，循环利用，即细胞的内
2、吞和外排两个过程保持基本的相对平衡。在整 个膜泡吞排作用（cytosis）中，必须有能量的保证。例如，膜泡组装形成过程中的小G 蛋白，运输过程中的细胞骨架及相应的马达蛋白，以及膜融合过程中Rab蛋白等均发生 GTP或ATP的水解反应。2、内膜系统：内膜系统是指内质网、高尔基体、囊泡、溶酶体和液泡等细胞器和质膜。这 些细胞器的膜是相互流动的, 处于动态平衡, 在功能上也是相互协同的。3、FM 类染料：是水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，使用方便。常广泛用于 质膜和囊泡等的各类研究常用的染料有FM1-43（Ex510/Em626）和FM4-64（Ex558/Em734）。 FM 类染料与质
3、膜及内膜细胞器特异结合后发出高强度的荧光。 FM4-64 由一条亲脂的尾 部和一个带正电荷的头部经双键相连而成的，亲脂尾部可以插入脂双层的外叶中，而头 部则阻止其进一步穿越脂双层，需要借助胞吞作用才能进入细胞内。 FM4-64 在水相中 没有荧光，只有插入脂质生物膜后才显示较强的荧光，胞吞回收的囊泡因吞进细胞内部 而被荧光标记，利用这种荧光探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。4、ER Tracker-Blue/White的作用原理：ER-Tracker Blue-White是 Dapoxyl 染料中的一种，它 的主要成分是格列本脲，是一种糖尿病患者每日降低血糖的药物。也被用于研究胰腺 B-
4、细胞活性和胰岛素分泌和研究心肌细胞功能和心律不齐。格列本脲连接到ATP-敏感K+ 通道的磺脲受体，这个受体主要在ER上。5、叠氮化钠 （抑制剂）:抑制细胞膜发生内吞作用。6、山梨醇（高渗液）：让细胞发生质壁分离。三、实验过程1、取3个共聚焦专用培养皿，分别编号、；2、往中加入198 含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和2 FM4-64；往中加入178 含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和20 山梨醇；往中加入194 含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和4 NaN3；3、置显微镜下观察中的荧光分布模式；4、观察完毕中的FM4-64后再往中加入4 ER Blue/white；5、
5、往、中分布加入2 FM4-64，随后先观察中的荧光分布;6、接着再观察中的荧光分布模式；7、最后再次观察中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧光分布。四、实验结果及分析图2：正常悬浮细胞的FM4-64标记图1正常悬浮细胞的FM4-64标记（荧光）图 3： ERtrackerBlue/white、FM4-64 和 GFP 的图 4： ERtrackerBlue/white、FM4-64 和 GFP 的图 5 ：质壁分离的 细胞的 FM4-64 标记（荧 图 6 ：质壁分离的 细胞的 FM4-64 标记 光）图 7 ：叠氮化钠处理的的悬浮细胞的 FM4-64 图 8：叠氮化钠处理的的
6、悬浮细胞的 FM4-64 标记（荧光） 标记分析：1、正常悬浮细胞的FM4-64标记：FM4-64先标记于细胞外周，即细胞膜。其为红色荧光显 示，并随着时间的延长逐渐进入细胞内部。（如图 1）2、叠氮化钠处理的的悬浮细胞的FM4-64标记：只有细胞外周为红色荧光，因为叠氮化钠 能抑制细胞的内吞作用，使FM4-64不会进入细胞内部，这样可以进一步说明FM4-64是通 过内吞作用而不是扩散进入细胞的。（如图 7）3、质壁分离的细胞的FM4-64标记：用山梨醇处理细胞2-3分钟，使细胞发生质壁分离。 结果显示，只有细胞膜被红色荧光标记，证明FM4-64是一种膜染料。（如图5）4、ERtrackerB
7、lue/white、FM4-64和GFP的三标记：细胞膜显示紫红色，而一部分细胞器显 示紫色（红色蓝色叠加）表明内吞的FM染料部分进入内质网等细胞结构。（如图3）总之，我们先通过正常悬浮细胞的FM4-64标记，得出染料可以与细胞外周某个结构结 合成红色荧光反应；我们再用质壁分离的细胞染色，得出是细胞膜被染成了红色。接着，我 们用叠氮化钠抑制细胞内吞作用，结果细胞内并没有其他结构被染色，证明了FM4-64染色 是不能通过扩散等方式进入细胞内的。最后，我们运用了三标记法重新观察了过了一段时间 的一号培养皿内细胞，发现染料已经通过内吞的方式进入了细胞内，从而更好地了解到了其 内吞作用的方式方法。五、改进与建议1、可以再让我们更多地接触荧光显微镜，更加熟悉其工作原理，过程，为以后的学习打下 基础。2、FM的量可以减少至1“L,这样可以使染色荧光效应不是很强烈，适合观察。3、取植物细胞时，应摇匀后再取，这样可以减少细胞数量密度，更好地观察单个细胞，从 而避免很多细胞粘连重叠不易观察。注：思考题见实验原理以及实验分析
植物细胞的胞吞作用和内膜系统的荧光显微观察
