第五节培养基medium

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1、第五节第五节 培养基培养基(medium)定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。特点：任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，特点：任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。用途：促进微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；用途：促进微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物鉴定微生物

2、种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品。制品。培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）物理化学条件适宜（条件适宜）物理化学条件适宜（条件适宜）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）一、培养基的配制原则一、培养基的配制原则（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（一）培养基组分应适合微生物的营养特点 即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基；不同营养即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基；不同营养类型的微生物，其对营养物的需

3、求差异很大。如类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。如自养型自养型微生微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质生物的培养基至少需要含有一种有机物质，但有机物的种类，但有机物的种类需适应所培养菌的特点。需适应所培养菌的特点。按微生物的主要按微生物的主要类群类群来说，它们所需要的培养基成分也来说，它们所需要的培养基成分也不同：不同：细菌：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；LB (Luria-Bertani)放线菌：放线菌：高氏一号培养基高氏一号培养基 真菌：真菌：查氏合成培

4、养基；查氏合成培养基；PDA(Potato-Dextrose-Agar)酵母菌；酵母菌；麦芽汁麦芽汁 当对试验菌营养需求特点不清楚的时候，可以采用当对试验菌营养需求特点不清楚的时候，可以采用“生生长谱长谱”法进行测定。法进行测定。浓度过高浓度过高微生物的生长起抑制作用，微生物的生长起抑制作用，浓度过小浓度过小不能满足微生物生长的需要。不能满足微生物生长的需要。碳氮比（碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，常作为考察培养基组成时的一个重要指标；形成与积累，常作为考察培养基组成时的一个重要指标；速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例速

5、效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例 各种金属离子间的比例各种金属离子间的比例 碳源中的碳原子的碳源中的碳原子的mol数数氮源中所含的氮原子的氮源中所含的氮原子的mol数数C/N比值比值=例：谷氨酸生产中例：谷氨酸生产中C/N 4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；C/N3/1 时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。（二）营养物的浓度与比例应恰当（二）营养物的浓度与比例应恰当（1）pH：各类微生物的最适生长各类微生物的最适生长pH值各不相同：值各不相同：细细 菌：菌：7.08.0放线菌：放线菌：7.58.5 酵母菌：酵

6、母菌：3.86.0霉霉 菌：菌：4.05.8 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为值会发生改变，为了维持培养基了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。节培养基的碳氮比。外源调节外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液（三）物理化学条件适宜（三

7、）物理化学条件适宜 磷酸缓冲液：磷酸缓冲液：pH值从值从6.07.6之间之间K2HPO4+HCl KH2PO4+KClKH2PO4+KOH K2HPO4+H2O加入加入CaCO3：CO32 HCO3 H2CO3 CO2+H2O+H+H+H+H培养基中所含氨基酸、肽、蛋白质等物质也可起到缓冲作用。培养基中所含氨基酸、肽、蛋白质等物质也可起到缓冲作用。渗透压渗透压等渗溶液等渗溶液 适宜微生物生长适宜微生物生长高渗溶液高渗溶液 细胞发生质壁分离细胞发生质壁分离低渗溶液低渗溶液 细胞吸水膨胀，直至破裂细胞吸水膨胀，直至破裂 大多数微生物适合在等渗的环境下生长，而有的菌大多数微生物适合在等渗的环境下生长

8、，而有的菌如如Staphylococcus aureus则能在则能在3mol/L NaCl的高渗溶液的高渗溶液中生长。能在高盐环境（中生长。能在高盐环境（2.86.2/L NaCl）生长的微生）生长的微生物常被称为嗜盐微生物（物常被称为嗜盐微生物（Halophiles）。）。（2）渗透压和）渗透压和awaw：水分活度（水分活度（water activity）各种微生物生长的水分活度：各种微生物生长的水分活度：0.60.99之间之间aw=PP0细菌细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌微生物微生物生长的生长的最低最低aw一般：一般：0.900.98嗜盐菌：嗜盐菌：0.75（约（约5.5mol/LNaCl）一般

9、一般：0.870.91高渗酵母：高渗酵母：0.610.65（0.1V以上的环境中均能生长以上的环境中均能生长)。厌氧微生物：只能在厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长。以下生长。兼性厌氧微生物：兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、以上呼吸、+0.1V以下发酵。以下发酵。培养基是多氧化还原偶的复杂电化学系统，测出的培养基是多氧化还原偶的复杂电化学系统，测出的Eh值仅代表值仅代表其综合结果。其综合结果。对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度。对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度。培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨

10、酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。（3）氧化还原电势）氧化还原电势(redox poyential)该培养基的应用目的，即：该培养基的应用目的，即：是培养菌体还是积累代谢产物？是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；（碳氮比低）；用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍

11、低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定的代谢产物；否加入特殊元素或特定的代谢产物；（四）根据培养基的应用目的选择原料及其来源（四）根据培养基的应用目的选择原料及其来源1.生态模拟：生态模拟：调查所培养菌的生态条件，查看调查所培养菌的生态条件，查看“嗜好嗜好”，对对“症症”下料下料初级天然培养基。初级天然培养基。2.查阅文献：查阅文献：查阅、分析文献，调查前人的工作资料，借查阅、分析文献，调查前人的工作资料，借鉴

12、人家的经验，以便从中得到启发设计有自己特色的培养鉴人家的经验，以便从中得到启发设计有自己特色的培养基配方。基配方。3.精心设计：精心设计：借助优选法或正交试验设计法等方法。借助优选法或正交试验设计法等方法。二、设计培养基的方法二、设计培养基的方法 当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉 的原料，的原料，提倡以粗代精，以废代好。提倡以粗代精，以废代好。4、实验比、实验比 较较：不同培养基配方的选择比较不同培养基配方的选择比较 单种成分来源和数量的比

13、较单种成分来源和数量的比较 几种成分浓度比例调配的比较几种成分浓度比例调配的比较 小型试验放大到大型生产条件的比较小型试验放大到大型生产条件的比较 pH和温度试验和温度试验 附附1 1：配置培养基时应注意的几个问题及解决方法：配置培养基时应注意的几个问题及解决方法：沉淀沉淀 胶体强度的破坏胶体强度的破坏 褐色物质的形成褐色物质的形成 pH发生变化发生变化高压蒸气灭菌：高压蒸气灭菌：一般培养基：一般培养基：1.05 Kg/cm2,121.3,1530 min。含糖培养基：含糖培养基：0.56 Kg/cm2,112.6,1530 min。干热空气灭菌：干热空气灭菌：160，2 h。过滤灭菌，分别灭

14、菌，过滤灭菌，分别灭菌，间歇灭间歇灭附附2：灭菌：灭菌附图：过滤灭菌菌，紫外光，化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾菌，紫外光，化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）的应用。甲醛）的应用。三、培养基的类型其应用三、培养基的类型其应用1.按对培养基成分的了解程度来分天然培养基天然培养基(complex medium)：也称作：也称作chemically undefined medium。利用化学成分还不完全清楚或不恒定利用化学成分还不完全清楚或不恒定的天然物质（如肉汤、蛋白胨、的天然物质（如肉汤、蛋白胨、麦芽汁、酵母汁、豆芽汁、麦芽汁、酵母汁、豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培养基，天然培养基比较玉米

15、粉、牛奶、血清等）制成的培养基，天然培养基比较经济，除实验室经常使用外，更适宜于在生产上用来大规经济，除实验室经常使用外，更适宜于在生产上用来大规模地培养微生物和生产微生物产品。模地培养微生物和生产微生物产品。合成（组合）培养基合成（组合）培养基(synthetic medium)：也称作：也称作chemically defined medium.由化学成分完全了解的由化学成分完全了解的物质配制物质配制而成的培养基，该类培养基的组成成分精确、清楚，重复性而成的培养基，该类培养基的组成成分精确、清楚，重复性强，但微生物生长较慢，且价格昂贵，故一般适于在实验室强，但微生物生长较慢，且价格昂贵，故一

16、般适于在实验室范围内有关微生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以范围内有关微生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。如高氏培养基、如高氏培养基、察氏培养基等。察氏培养基等。半组合培养基半组合培养基(semi-defined medium)：在合成培养基的基在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要，如马铃薯蔗糖培养基。要，如马铃薯蔗糖培养基。液体培养基液体培养基(liquid medium)：液体培养基不含任何凝固液体培养基不含任何凝固剂

17、，菌体与培养基充分接触，操作方便，常用于大规模的剂，菌体与培养基充分接触，操作方便，常用于大规模的工业生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的工业生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的研究工作。可据培养后的浊度判断微生物的生长程度。研究工作。可据培养后的浊度判断微生物的生长程度。固体培养基固体培养基(solid medium)：天然固体营养基质制成的：天然固体营养基质制成的培养基，或液体培养基中加入一定量凝固剂（琼脂培养基，或液体培养基中加入一定量凝固剂（琼脂1.52%)而呈固体状态的培养基。为微生物的生长提供营养表而呈固体状态的培养基。为微生物的生长提供营养表面。常用于微生物的

18、分离、纯化、计数等方面的研究。可面。常用于微生物的分离、纯化、计数等方面的研究。可依使用目的不同而制成斜面、平板等形式。依使用目的不同而制成斜面、平板等形式。2.按制备后培养基外观的物理状态来分半固体培养基半固体培养基(semi-solid medium)：在液体培养基中加：在液体培养基中加入入0.20.7%的琼脂构成的培养基。常用来观察细菌运动的的琼脂构成的培养基。常用来观察细菌运动的特征，以进行菌种鉴定和噬菌体效价滴定等方面的实验工特征，以进行菌种鉴定和噬菌体效价滴定等方面的实验工作。作。脱水培养基（脱水培养基（dehydrated culture media）：脱水商品培：脱水商品培养基

19、，预制干燥培养基，指含有除水以外的一切成分的商养基，预制干燥培养基，指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分精确又有使用方便等优点的现代化培养基。一类既有成分精确又有使用方便等优点的现代化培养基。1.不被微生物分解、利用、液化；不被微生物分解、利用、液化；2.不因消毒灭菌而被破坏；不因消毒灭菌而被破坏；3.在微生物的生长温度内保持固态；在微生物的生长温度内保持固态；4.凝固点的温度对微生物无害；凝固点的温度对微生物无害；5.透明度好，粘着力强。透明度好，粘着力强。理想凝固剂应具备的条件理想凝固剂

20、应具备的条件比较内容比较内容琼脂琼脂明胶明胶常用浓度常用浓度熔点熔点凝固点凝固点pH灰分（灰分（%）氧化钙（氧化钙（%）氧化镁（氧化镁（%）氮氮微生物可利用能力微生物可利用能力1.52%9640微酸微酸161.150.770.4绝大多数微生物不能利用绝大多数微生物不能利用512%2520酸性酸性14-150018.3不少微生物能利用不少微生物能利用琼脂琼脂(agar):石花菜中提取的高度分支的复杂多糖石花菜中提取的高度分支的复杂多糖明胶明胶(gelatin):胶原蛋白制备产物胶原蛋白制备产物硅胶硅胶(silica gel):硅酸纳与盐酸聚合而成，硅酸纳与盐酸聚合而成，纯无机物纯无机物凝固剂种类

21、凝固剂种类:基础培养基基础培养基(minimum medium):是含有一般微生物生是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基；长繁殖所需的基本营养物质的培养基；另外基础培养基也另外基础培养基也可作为一些特殊培养基的基础成分（如制备糖发酵培养基可作为一些特殊培养基的基础成分（如制备糖发酵培养基时）。时）。选择性培养基选择性培养基(selective medium)：是根据某种或某一类：是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要，或对某种化合物的敏感性不同群微生物的特殊营养需要，或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可用来将某种而设计出来的一类培养基。利用这种培养

22、基可用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。3.按特殊用途划分鉴别性培养基鉴别性培养基(differential medium)：用于鉴别不同类型用于鉴别不同类型微生物的培养基，在普通培养基中加入能与某种代谢产物微生物的培养基，在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物，例：性变化，以区别不同的微生物，例：伊红美兰乳糖培养基伊红美兰乳糖培养基（Eosin Methylene Blue）。）。加富培养基加富培养基(enrich

23、ed medium)：在普通培养基中加入某在普通培养基中加入某些特殊的营养物，如血、血清、动、植物组织液或其他营些特殊的营养物，如血、血清、动、植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。用来培养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求苛刻的微生物，或用以富集（数量上占优势）养营养要求苛刻的微生物，或用以富集（数量上占优势）和分离某中微生物。和分离某中微生物。G G+菌受抑制菌受抑制G G-菌菌能发酵乳能发酵乳糖产酸糖产酸不发酵乳糖不产酸，不发酵乳糖不产酸，菌落无色透明菌落无色透明产酸力强，产酸力强，菌落呈紫绿菌落呈紫绿色金属光泽色金属光泽产酸力弱，产酸力弱

24、，菌落棕色菌落棕色EnterbacterKlebsiellaHafniaSarrdiaProteusSalmonellaShigellaE.coli试试样样EMB在鉴别各种肠道杆菌中的作用：在鉴别各种肠道杆菌中的作用：Left:Escherichia coli cells.Right:E.coli colonies on EMB Agar.EMB(Eosin Methylene Blue)细菌培养基细菌培养基营养肉汤（营养肉汤（nutrient broth)：牛肉膏牛肉膏 3g；水水 1000ml；蛋白胨蛋白胨 5g；pH 7.27.4放线菌培养基放线菌培养基高氏高氏1号：号：可溶性淀粉可溶性

25、淀粉 20g；KNO3 1g;K2HPO4 1g MgSO4 0.5g NaCl 1g;FeSO47H2O 0.5g 水水 1000ml;pH 7.27.4霉菌培养基霉菌培养基查氏（查氏（zapek)培养基：培养基：蔗糖蔗糖 30g;KCl 0.5g;MgSO4.H2O 0.5g;FeSO4 0.5g 水水 1000ml;K2HPO4 1g;NaNO3 3g;pH 6.7酵母菌培养基酵母菌培养基麦芽汁培养基麦芽汁培养基 细菌培养基细菌培养基 放线菌培养基放线菌培养基 霉菌培养基霉菌培养基4.根据所培养的微生物类群来分种子培养基种子培养基(seed culture medium)：是为保证发酵生

26、产是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基，特点是营养较丰富，获得大量优质种子而设计的培养基，特点是营养较丰富，氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件，氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件，还有意识地加入发酵培养基的基质。还有意识地加入发酵培养基的基质。发酵培养基发酵培养基(fermentation medium)：用于生产预定发酵用于生产预定发酵产物，一般碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时，产物，一般碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时，原料应价廉易得，还应有利于下游的分离提取原料应价廉易得，还应有利于下游的分离提取。5.根据培养目的来分味精生产菌北

27、京棒状杆菌味精生产菌北京棒状杆菌AS1299：一级种子（用摇床培养）培养基配方：一级种子（用摇床培养）培养基配方：葡萄糖葡萄糖 3%玉米浆玉米浆 2.53.5%尿素尿素 0.30.5%K2HPO4 0.10.2%MgSO4 0.05%二级种子（二级种子（1200升发酵罐）培养基配方：以水解糖升发酵罐）培养基配方：以水解糖3%代代替葡萄糖替葡萄糖3%，其他成分相同。，其他成分相同。The powder is weighed and dissolved in a specified amount of water.pH is checked and adjusted.Then the medium is sterilized at 121 C at 15 lbs/sq.in.pressure for 15 minutes.Heat labile compounds that are to be added to the medium should be sterilized by filtration,and then added to the medium at 50 C.Media Preparation