微生物基本试验原理及操作

《微生物基本试验原理及操作》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物基本试验原理及操作（83页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、l碳源和氮源利用试验 l碳水化合物的代谢试验 l各种酶类试验 l氨基酸和蛋白质代谢试验 l柠檬酸盐试验 l葡萄糖酸盐试验 l原理：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解柠檬酸钠生成碳酸钠，使培养基呈碱性。能利用柠檬酸盐作唯一碳源的细菌，也能利用铵盐作为唯一氮源，铵盐被分解为氨而产生碱性。l MgSO4-7H2O 0.2glNH4H2PO4 1glK2HPO4 1gl柠檬酸钠 5gl氯化钠 5gl琼脂 20gl0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40mll蒸馏水 1000ml结果：阳性者表面上长有菌落，培养基变为蓝色。l原理：检查细菌是否具有氧化葡萄糖作为唯一碳源，并具有还原2-酮基葡萄糖酸盐与班氏试剂

2、混合加热生成黄红色酮类的能力。l方法：接种大量待检菌于培养基内，35，24-48小时，0.5ml培养基加班氏试剂3滴左右，加热煮沸后观察结果。l蛋白胨 0.15gl酵母浸膏 0.1gl磷酸二氢钾 0.1gl葡萄糖酸钾（或钠）4gl蒸馏水 100mll结果：出现黄色到橙红色沉淀为阳性，无颜色变化为阴性。l氧化-发酵试验（OF试验）l糖醇发酵试验 lB半乳糖苷酶试验（ONPG试验）l甲基红试验 lVP试验 l 胆汁七叶苷试验 l 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的称为氧化型；在无氧条件下降解葡萄糖的称为发酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可以区别细菌的代谢类型。l蛋白胨

3、 2gl磷酸氢2钾0.3克l氯化钠 5gl葡萄糖 10gl0.2%溴麝香酚蓝溶液 12mll琼脂 2.5gl蒸馏水 1000mll方法：将待检菌接种于二支Hugh-Leifson培养基的试管中，均用接种针穿至管底，其中五支加入灭菌的液体石蜡约1厘米厚。35，培养48小时观察结果。培养基颜色变黄即为产酸。l 代谢类型 加蜡封口管 开放管l发酵型 产 酸 产 酸l氧化型 不变色 产 酸l产碱型 不变色 不变色l l原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇类的酶，所以分解糖、醇类的能力各不相同。分解糖、醇类后产生的代谢产物可因菌种不同而异，有的产酸、产气，有的仅产酸，故用于鉴别细菌。l蛋白胨水或肉膏汤 1

4、00mll所需的糖、醇或苷类 0.5或1gl1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 0.1mll 接种的细菌，若能耐分解培养基中的糖类产酸时，则使培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使半固体培养基内或液体培养基中的倒管内出现气泡。若不分解则无变化。l原理：有的细菌可产生B-半乳糖苷酶，此酶可分解邻-硝基酚-B-D-半乳糖苷（ONPG）。ONPG为无色，经B-半乳糖苷酶水解后，可产生黄色的邻硝基酚，即使浓度很低也能检出。l呈现黄色为阳性反应。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，本试验可作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。l 原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步被分解为甲酸

5、、乙酸、乳酸等，而使培养基的pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。l原理：有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醛、气体和水），则培养基的酸碱度仍在6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色（阴性）。l多价蛋白胨 7gl葡萄糖 5gl磷酸氢二钾 5gl蒸馏水 1000ml 方法：被检菌接种于上述培养基内，于35培养48小时，于2ml培养液内加甲基红指示剂2滴，立即观察结果。l结果：红色为阳性；桔红色为弱阳性；黄色为阴性。l原理：有些细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧后可产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气的氧氧化为二乙酰

6、（丁二酮），进而与培养基内蛋白胨中的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即VP反应阳性。培养基中的胍基太少时，加入少量含胍基的化合物，如肌酸或肌酸酐等，可加速此反应。试剂：甲液：6%a-萘酚乙醇溶液 乙液：40%氢氧化钾溶液l方法：将被检菌接种葡萄糖蛋白胨水培养基后，于35培养48小时，于2ml培养基内加入甲液1ml和乙液0.4ml，振摇后观察结果。l结果：于数分钟内呈红色为阳性；如无红色出现，而且于35中4小时后仍如故者即为阴性。本试验较为敏感。l原理：在10-14%胆汁存在下，测定细菌水解葡萄糖苷七叶苷为七叶亭和葡萄糖的能力。l 蛋白胨 5gl 牛肉浸膏 3gl 牛胆汁（胆汁）40g

7、l 七叶苷 1gl 柠檬酸铁 0.5gl 琼脂 15gl 蒸馏水 1000mll结果：培养基变为黑色或深褐色为阳性。有生长物时，并不表示七叶苷裂解，仅表示胆汁浓度不能抑制D群链球菌外的细菌生长。l过氧化氢酶（触酶）试验 l氧化酶试验 l血浆凝固酶试验 l硝酸盐还原试验l胆汁溶解试验l环腺苷酸（cAMP）试验 l原理：有些细菌具有过氧化氢酶，能将过氧化氢酶分解为水。l试剂：3%过氧化氢溶液。l方法：玻片法：用牙签挑取1824小时培养的菌苔，置于洁净的玻片上，滴加3%过氧化氢溶液12滴。试管法：取不含血液的1824小时培养物一接种环于试管内，加入1ml 3%过氧化氢溶液。3%过氧化氢溶液应置于棕色

8、瓶内冷藏。l结果：产生大量气泡为阳性，不产生气泡为阴性。l原理：凝固酶能凝固血浆纤维蛋白，是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验。本试验分玻片法和试管法，玻片法主要是检测结合凝固酶，试管法是为了肯定玻片法试验结果和对玻片法试验阴性者进行复查，检测游离凝固酶。l原理：结合凝固酶为金黄色葡萄球菌细胞表面含有，游离凝固酶为金黄色葡萄球菌产生的一种胞外酶，两酶均可作用于血浆中的纤维蛋白原，使其转变为纤维蛋白，形成凝块。方法：l玻片法：在玻片上加一滴灭菌生理盐水，取葡萄球菌18-24小时肉汤培养物一环，或挑取平板上一个单个菌落制成浓菌悬液，再加一接种环新鲜人或兔血浆与菌悬液混匀。同时做阳性菌和阴性菌对照试验，立

9、刻观察凝块的形成。本试验应先在生理盐水中乳化，检查有否自凝现象。防止出现假阳性结果。阳性结果一般在5-20秒内出现，若3-4分钟后仍无凝固，可考虑为玻片法试验阴性。l试管法：将洁净小试管中加0.5ml未稀释的人或兔血浆，加0.5ml培养18-24小时的葡萄球菌肉汤培养物一满环，或挑取平板上的纯菌落，轻轻转动（不要摇动）试管混匀。放35水浴中4小时，每隔30分钟检查一次有无凝固。检查时不要振动或摇动试管，可轻轻将试管倾斜以观察有无凝块。大多数金黄色葡萄球株在354小时可以凝固血浆，如果阴性对照。枸椽酸盐抗凝的血浆可产生假阳性结果。原理：某些细菌具有氧化酶，在有氧和细胞色素C时，使还原型细胞色素C

10、氧化，氧化型细胞色素C再使二甲基对苯二胺氧化，产生玫瑰红至暗紫色。有时菌落本身带有红色，不易观察，可再加入a-萘酚乙醇溶液，使生成深蓝色的靛酚蓝。l 试剂：l1 1%盐酸二甲基对苯二胺（或四甲对苯二胺）水溶液l2 1%a-萘酚95%乙醇溶液l 方法：取18-28小时的新鲜培养物，用无菌滤纸条，蘸取菌落少许，滴加1%盐酸二甲基对苯二胺1-2滴，观察结果。l 结果：一分钟内出现紫红色为阳性。若菌落本身有色素，则再滴加a-奈酚1-2滴，出现蓝色则为阳性。l原理：硝酸盐还原反应有两个过程，其一是硝酸盐还原为亚硝酸盐，其二是继续将亚硝酸盐进一步分解为氨、氮、氧化氮等气体终末产物。l 蛋白胨 1gl 硝酸

11、钾 0.1gl 蒸馏水 100mll方法：将待检菌接种于硝酸盐培养基中，35培养1-4天，将甲、乙试剂各加0.1ml于试管内，混匀观察结果 l 结果：出现红色为阳性。如无红色出现，应加少量锌粉，如仍无红色说明亚硝酸盐进一步分解成氮、氨等气体，应判为阳性；如加锌粉出现红色，说明还原剂锌粉使硝酸盐还原为亚硝酸盐，待检菌无还原硝酸盐的能力，为阴性。l 原理：在特定时间和温度条件下测定胆盐溶解细菌的能力。溶菌的机理尚未定论，有人认为胆盐或胆汁能激活肺炎链球菌的自溶酶，使菌体发生溶解。l试剂：10%去氧胆酸钠溶液或牛胆汁 l平板法：10%去氧胆酸钠溶液一接种环，加于血琼脂平板的试验菌落上，置于35孵育3

12、0分钟，肺炎链球菌菌落消失为阳性。阴性者菌落仍存在。l 原理：B群链球菌（无乳链球菌）能产生一种因子（cAMP因子），这种因子在绵羊血或牛血培养基上与金黄色葡萄球菌-溶血素起协同作用，促进-溶血素的活性。因此在两种细菌的交界处溶血力增加，出现箭头形溶血区。l方法：首先在羊血平板上接种一长条金黄色葡萄球菌（药敏质控菌）再将被检菌与金黄色葡萄球菌接种线垂直接种一短条，两者不能相交，应相距3mm左右，同时在被检菌接种线对侧，用同样方法接种阴性和对照菌，35培养过夜，如放在CO2烛缸内结果更为好看（金黄色葡萄球菌用ATCC25923为佳）。l结果：在被检菌接种线与金黄色葡萄球菌接种线处出现一个矢状加强

13、溶血区，为CAMP阳性。阴性无加强溶血区。l吲哚试验 l硫化氢试验 l苯丙氨酸脱氨酶试验 l氨基酸脱羧酶试验（赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸）l脲酶试验 l明胶液化试验 l原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），经与试剂 中的对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。l蛋白胨（或胰胨）10-20gl氯化钠 5gl蒸馏水 1000ml kovac氏试剂l对二甲氨基苯甲醛 10gl纯戊醇 150mll纯浓盐酸 50mll 先将试剂溶于醇中，缓慢加入盐酸即成。l 方法：挑取纯培养物接种蛋白胨水培养基，于35培养1-2天，沿管壁徐徐加入kovac氏试剂0.5ml，使成两层，观察结果。l结果：在两

14、者液面交界处出现红色为阳性，无色为阴性。l原理：细菌分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）和含硫化物生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子生成黑色的硫化物。由此间接地检测细菌是否产生硫化氢。l培养基：三糖铁培养基或克氏双糖铁培养基 l结果：培养基黑为阳性，无变化为阴性。l原理：细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，能使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，苯丙酮酸与铁离子作用生成绿色络合物。lDL苯丙氨酸 0.2g（L苯丙氨酸0.1g）l 酵母浸膏 0.3gl 氯化钠 0.5gl 磷酸氢二钠 0.1gl 琼脂 1.2gl 蒸馏水 100mll试剂：10%三氯化铁溶液：将10克三氯化铁溶于100ml蒸馏水中即成。l方

15、法：将待检菌接种于培养基斜面上，35培养24小时，滴加三氯化铁试剂，观察结果。l结果：培养基斜面上显绿色为阳性，不变色为阴性。l原理：检查细菌使氨基酸脱去羧基，生成胺类化合物，使培养基变碱的能力。l蛋白胨 5gl酵母浸膏 3gl葡萄糖 1gl6%溴甲酚紫洒精溶液 1mll蒸馏水 1000mll将上述成分溶于蒸馏水，然后加进所需氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸、精氨酸），使其浓度为.。对照管不加氨基酸。l方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封灭菌液体石蜡，35培养24小时以上观察结果。l培养基pH应偏酸，有利于酶的形成。l加封液体石蜡造成厌氧环境，在厌氧环境下氨基酸脱羧生成的胺才稳定，另外也可

16、避免出现假阳性。l如对照管不变色则不能判断结果。l 结果：接种待检菌的测定的培养基是紫色，对照管是黄色为阳性；两管均是黄色为阴性。l原理：某些细菌能产生脲酶。脲酶 可分解尿素，尿素经分解后产生大量的氨，使培养基变碱。l蛋白胨 1gl氯化钠 5gl葡萄糖 1glKH2PO4 2gl20%尿素水溶液 100mll琼脂 15gl0.1%酚红水溶液 12mll 蒸馏水 900mll方法：将被检菌接种于尿素培养基后，置35培养18-24小时观察结果。阴性应观察4天。l结果：细菌分解尿素后培养基变红为阳性，不变为阴性。l原理：明胶酶是细菌产生的一种胞外酶，能分解明胶为氨基酸，从而失去凝固力，使半固体的明胶培养基成为液体。l于普通琼脂中加入1%明胶即成。l方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20培养7天，逐日观察明胶液化现象。l如室温高培养基自行溶化时，可于冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果。另取一支未接种细菌的培养基为对照管。l结果：明胶培养基倒置有液化为阳性，仍凝固者为阴性。l快速明胶液化试验 取培养18-24小时斜面或平板菌苔，用0.5-1ml无菌生理盐水制成浓菌悬液,放入一条未显影的X线胶片（已曝光胶片对此试验无影响），置37水箱。于1、4和24小时观察结果，浸入液体一端胶片的蓝灰色明胶层脱落成透明者为阳性，阳性菌株大都在1-4小时内液化，24小时仍未脱落为明胶酶阴性。再见！