补体的测定及应用

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1、补体的测定及临床应用 n补体是一组存在于人和脊椎动物血清中具有酶样活性、不耐热的糖蛋白n补体不是单一成分，在功能效应上是以连续反应的程序进行的，故又称补体系统n补体系统由补体固有成分、补体调节蛋白和补体受体组成n补体的存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清中，含量相对稳定，但某些疾病时，含量及其活性可发生改变n补体含量与活性的检测，对机体免疫状态的评价和疾病的诊断具有重大意义补体的含量n补体大多为糖蛋白，属于球蛋白n正常血清中补体各组分含量相差较大，其中C3含量最高。n补体主要在血液和肝脏中进行代谢，代谢率快，每天更新一半补体的理化特性n补体性质不稳定，容易受各种理化因素的影响n补体标本保存

2、在-20补体的活化途径n1、经典途径 以抗原抗体复合物结合C1q启动激活的途径，又称第一途径或传统途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式n2、MBL途径 MBL结合至细菌启动的途径，激活剂是机体的炎症反应急性期时产生的MBL和C反应蛋白等n3、旁路途径 通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，不依赖特异性抗体的形成，在感染早期可为机体提供有效的防御。在机体感染的过程，首先活化和发挥作用的是旁路途径和MBL途径，在特异性抗体产生时，经典途径才可发挥作用经典激活途径经典激活途径替代激活途径替代激活途径MBLMBL途径途径激活物质激活物质抗原抗体复合物抗原抗体复合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖肽聚糖

3、、酵母多糖、脂多糖MBLMBL相关的丝氨酸蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶起始分子起始分子C1qC1qC3C3C2C2、C4C4参与补体成分参与补体成分C1C1、C4C4、C2C2、C3C3、C5-C9C5-C9C3C3、C5-C9C5-C9、B B因子、因子、D D因子因子C2-C9C2-C9、MASPMASP所需离子所需离子CaCa2+2+、MgMg2+2+MgMg2+2+CaCa2+2+C3C3转化酶转化酶C4b2bC4b2bC3bBbC3bBbC4b2bC4b2bC5C5转化酶转化酶C4b2b3bC4b2b3bC3bnBbC3bnBbC4b2b3bC4b2b3b生物学作用生物学作用参与特异性免

4、疫的参与特异性免疫的效应阶段效应阶段,感染后期感染后期发挥作用发挥作用参与非特异性免疫的参与非特异性免疫的效应阶段效应阶段,感染早期感染早期发挥作用发挥作用参与非特异性免疫的参与非特异性免疫的效应阶段效应阶段,感染早期感染早期发挥作用发挥作用补体总活性测定n补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称CH50.CH50通常是指CP-CH50（经典途径）CH50的测定方法n原理 应用绵羊红细胞（SRBC）和其相应的抗体（溶血素），作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性

5、相关（特殊的S性关系）。将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性CH50测定方法1、红细胞浓度的调整 绵羊红细胞（SRBC）采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏（Alsever）血液保存液制成抗凝血，4保存备用。使用前，调制成2%5%SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入2030倍的稀释液，在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。2、溶血素滴定n溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化n试验前需先行加热56 30min或60 3min以灭活补体n溶血素有商品销售，可按标识效价稀释

6、使用n自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用2个单位。n溶血素效价稳定，一般使用3个月后再作重新滴定3、稀释缓冲液n磷酸缓冲液等nPH7.2-7.4n加入适量NACL,保存等渗nCa2+、Mg2+50%溶血标准管CH50的计算nCH50(U/ml)=1/血清用量稀释倍数n不同的CH50测定方法，其活性参考范围不一样，一般以反应总体积2.5ml为常用，参考范围50-100U/ml.方法学评价和临床意义n方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比外，还与反应所用的缓冲液、外，还与反应所用的缓冲液、S

7、RBC的数量以及反应温度有关的数量以及反应温度有关 n总补体活性的参考范围为总补体活性的参考范围为50100U/ml nCH50增高见于：增高见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等nCH50降低见于：降低见于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎、急性肾小球、急性肾小球肾炎等肾炎等单个补体成分的测定n常作为单个补体成分的检测指标：C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等n测定方法：免疫溶血法（检测单个补体成分的活性）化学法（检测单个补体成分的含量）自动化免疫散射比浊法免疫溶血试验n试验依据：抗原抗体结合后可激活

8、补体的经典途径，可导致细胞溶解n指示系统:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统n参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照 参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清 n结果判度:若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分活性呈正比，仍以50溶血为终点 n免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等补体成分的检测。其中以C3、C4两成分的检测更为常见 免疫化学法免疫化学法分类免疫化学法分类 1.单向免疫扩散单向免疫扩散 2.火箭免疫电泳火箭免疫电

9、泳 3.透射比浊法透射比浊法 4.散射比浊法散射比浊法 前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰。后两种方法：通过仪器结果重复性差，已趋于淘汰。后两种方法：通过仪器对补体的对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行自动化测定因子等单个成分进行自动化测定 补体结合试验n补体结合试验补体结合试验(complement fixation test，CFT)将免疫溶血作为指示系统，将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应用以检测另一反应 系统中抗原或抗体的系统中抗原或抗体的传统方法。是利用补体的溶细胞作用进传统方法。是利用补体的

10、溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定。行各种物理状态的抗原抗体测定。n试验有5种成分参与，分属3个系统 1、反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）2、补体系统 3、指示系统：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（SRBCS）。n反应分两步进行 第一步:反应系统与补体的作用 第二步:指示系统利用剩余补体的反应 不溶血为补体结合试验阳性，反应系统含待测抗原（或抗体）；不溶血为补体结合试验阳性，反应系统含待测抗原（或抗体）；而溶血为试验阴性，说明反应系统不含待测抗原（抗体）而溶血为试验阴性，说明反应系统不含待测抗原（抗体）试剂准备n抗原或抗体 1、用于试验的抗

11、原或抗体:需要纯化；纯度愈高，特异性愈强 2、抗原与抗体比例适当:确定抗原或抗体相应的使用单位；采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定n补体 1、多采用豚鼠血清为补体 2、补体的量为恒量 3、对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血的最少补体用量为1个实用单位，正式试验时使用2个实用单位。4、补体的性质不稳定，试验前均应进行滴定 n待测标本 1、采血并及时分离血清用于检测或20保存备用。2、试验前，应先将血清56加热30min（或603min）以灭活补体。n血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理：加热灭活时提高12 20冻融后离心去沉淀 以3mmol/L盐酸处理 加入少量补体后再行灭活 以白陶

12、土处理 通入CO2 以小白鼠肝粉处理 用含10新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清正式试验n分类分类:小量法、微量法，以小量法常用小量法、微量法，以小量法常用n实验过程实验过程:稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、补体温育稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、补体温育 与指示系统共育与指示系统共育结果判度结果判度:对照管对照管:阴性对照管阴性对照管:溶血溶血 阳性对照管阳性对照管:不溶血不溶血 抗体或抗原对照管抗体或抗原对照管:完全溶血完全溶血 待检血清对照管待检血清对照管:完全溶血完全溶血 绵羊红细胞对照管绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血不出现自发性溶血 补体对照管：补体对照管：受检血清受检血清 阳

13、性阳性:不溶血不溶血 阴性阴性:溶血溶血 注意注意:若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。2 2个单位个单位:全溶全溶1 1个单位个单位:全溶或略带少许红全溶或略带少许红细胞细胞 0.50.5个单位个单位:不发生溶血不发生溶血三三、方法评价、方法评价 优优 点点灵敏度高、所测定的抗体水平可达灵敏度高、所测定的抗体水平可达0.05g/ml 0.05g/ml，出现交叉反应的机率较小，出现交叉反应的机率较小，可检测的抗原或抗体范围广泛，可检测的抗原或抗体范围广泛，无需

14、特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高 现现 状状影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃渐被遗弃补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用 补体测定的应用n补体相关试验：补体相关试验：诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应（已淘汰）HLA分型的补体

15、依赖性细胞毒试验 抗原抗体检测的脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验 抗体形成细胞定量检测的溶血空白斑技术 免疫复合物测定的胶固素结合试验和C1q结合试验应用于补体含量和活性检测的试验应用于补体含量和活性检测的试验 AP-CH50AP-CH50和和AP-H50AP-H50试验试验:反映总补体反映总补体活性活性 溶血试验溶血试验 免疫化学试验免疫化学试验 免疫荧光技术免疫荧光技术检测补体单个检测补体单个成分及其裂解产成分及其裂解产物（物（C1qC1q、C3SP C3SP、C3C3、C4C4、B B因子等）因子等）和补体受体和补体受体(图图)血管神经性水血管神经性水肿肿补体含量和活性相关的疾病1免疫相

16、关性疾病：免疫相关性疾病：如自身免疫性疾病时，如自身免疫性疾病时，C1C1、C2C2、C3C3、C4C4和和HfHf等缺陷；等缺陷；超敏反应时（超敏反应时（IIIIII型超敏反应），型超敏反应），C3aC3a、C5aC5a等过敏毒素的产生。等过敏毒素的产生。2与补体有关的遗传性疾病：与补体有关的遗传性疾病：C2C2、C3C3缺陷导致的严重感染；缺陷导致的严重感染；与与C1C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿肿 SLESLE患者出现的细胞表面患者出现的细胞表面CR1CR1缺陷与缺陷与C1CC1C清清除障碍除障碍 涉及涉及I I因子、因子、H H因子缺陷的肾小

17、球肾炎；因子缺陷的肾小球肾炎；DAFDAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；C1qC1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及及C1qC1q、C1rC1r、C4C4、C2C2缺陷造成的缺陷造成的 免疫复合物性血管炎（包括肾炎）免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。等。(图图)血管神经性水血管神经性水肿肿3补体含量显著降低的疾病补体含量显著降低的疾病：消耗增多消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多多.如如SLE.SLE.补体的大量丢失补体的大量丢失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者病患者补体合成不足补体合成不足:常见于肝脏疾病患者或营养不良的病常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。人。4高补体血症：高补体血症：偶见于感染恢复期和某些恶性肿偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。