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1、银杏叶提取黄酮及分离纯化组员：李佳辉、黄埔、赵超武一、 实验目的1. 掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黄酮进行提取2. 掌握紫外分光光度计的应用，以及相关溶液的配置3. 学会自主设计实验，培养团队合作精神二、实验原理关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且 抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用；实验需设置空白参比液，由文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为510nm;本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黄酮的质量浓度，因为黄酮其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黄酮类化合物与 铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm
2、（左右）处有 吸收峰，且符合定量分析的朗伯一比尔定律（即A=kbc） 般与芦丁标准溶液比较 定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄 酮类化合物开环，生成2-羟基查尔酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类邻位无取 代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黄酮类成分加入上述试剂 时是不显色的。（如二氢黄酮类化合物就不发生该显色反应）目前银杏叶黄酮的提取方法主要有：溶剂提取法、超临界流体萃取法（SFE 法）、高速逆流色谱技术提取法（HSCCC）微波提取法、超色波提取法、酶提取法、 分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单，所需试剂廉价易得，故通常使用此法来进 行大规模
3、生产。其工艺流程如下：银杏叶一-粉碎一-NaOH-6O%乙醇回流提取一-离心一-过滤一-滤液收 集一-二次醇提一-合并两次滤液一-树脂吸附一-脱吸一-浓缩一-干燥一-提 取物由于银杏叶黄酮中的类黄酮主要为芦丁，故用芦丁为对照物绘制标准曲线， 并采用分光光度法进行测定。三实验材料及器材1. 材料酸银杏叶、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95乙醇、磷酸氢二钠、 磷二氢钠、D101大孔吸附树脂、盐酸2. 相关溶液的配制和树脂预处理0.20mg/mL 芦丁标准溶液（500mL）、5%NaN02 （500mL）、10%AI（N03）3 （500mL）、1molLNaOH 、0.4molLNaOH（50
4、0mL）、0.4molL HCl（500mL）、 30%乙醇（500mL） 30%乙醇(1) D1O1树脂预处理(500g):商品树脂均残留惰性溶剂，故使用前根据应 用需要，必须进行不同深度的预处理，在提取器内，加入高于树脂层10-20厘米的 乙醇浸泡34小时，然后放净洗涤液，为一次提取过程。用同样方法反复洗至出 口洗涤液在试管中加3倍量水不显浑浊为止，后用清水充分淋洗至无明显乙醇气 味，即可进行一般使用。(2) 芦丁标准溶液：精密称取在105C常压干燥至恒重的芦丁对照品20mg, 置于100 mL容量瓶中，加30%乙醇约30mL，置水浴微热使之溶解，放冷，加30 %乙醇稀释至刻度，摇匀得芦丁
5、标准溶液(0.20mg/mL)(3) 、5% NaN02的配制：准确称取5g NaN02加入到95g蒸馏水中溶解。(4) 、10% AI(NO3)3的配制：准确称取10g AI(NO3)3加入到90g蒸馏水中溶解。(5) 、1mol/L NaOH的配制：称取5g NaOH于一定量蒸馏水中溶解，再 定容至100mL。(6) 、0.4mol/L NaOH 的配制：称取1.6gNaOH 于一定量蒸馏水中溶解，再定容至100mL。(7) 、0.4mol/L HCl的配制：取4ml的36.5%的HCl溶于100ml蒸馏水中3. 仪器紫外可见光分光光度计、干燥箱、旋转蒸发仪、离心机、回流装置、恒温水 浴锅
6、、中药粉碎机、容量瓶四、实验步骤1原料准备：称取200g银杏叶洗净，于80C下干燥，干燥后于中药粉碎机 中粉碎，备用。2. 黄酮的提取(银杏叶每组10g)(1) 一次醇提：准确称取银杏叶粉末10g，放入索是氏提取器中，用浓度为 60%乙醇溶液按1:8 (g/ml)混合均匀，在80C下回流1.5h,(2) 离心：在 3500r/min 下离心 10min；(3) 过滤：真空抽率，滤液收集；(4) 二次醇提：滤渣用浓度为60%乙醇溶液按1:8 (g/ml)混合均匀，进行二次 醇提，方法同上(5) 合并两次滤液，将滤液置于100ml容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀释至刻 度3. 黄酮的纯化层析柱制备：
7、(1) 准备：D101大孔吸附树脂预处理并充分吸涨(2) 湿法装柱：将吸涨后的树脂与溶剂的混合物倒入色谱柱中，让其自行沉 积。(50ml)(3) 上样：将样品溶液从柱的上端以较快速度加入(4) 洗脱：待样品完全上柱后，用 30%乙醇进行洗脱，并在下端收集洗脱 液。（5）浓缩：将洗脱下来的样品进行浓缩（6）干燥（7）得到产品（8）样品浓度测定操作方法：3.1装柱将D101大孔吸附树脂用丙酮浸泡过夜（大约15-18h），用水浴回流8h,过滤 （或抽滤），用水洗至溶液：水（1:2）不产生混浊为止，浸泡在水中，再进行装 柱，并在柱顶加少量氧化铝，制成预处理柱，备用。3.2样品预处理精密吸取样品5ml（
8、固体样品制成相当浓度的溶液），加入已处理好的D101大 孔树脂层析柱中，用100ml水洗脱（含蔗糖样品用300ml水），洗液弃去（流速 1.5ml/min）。再以原流速用30ml无水乙醇分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用 无水乙醇溶解，定量转移至5ml容量瓶中，稀释至刻度，作为供试品溶液。4. 黄酮含量的测定（1）标准曲线绘制精密量取 0.2mg/ml 芦丁标准溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,分别置于10.0 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL,摇匀；放置6min，加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀；再放置6 min，加4%
9、氢 氧化钠溶液2mL，加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以第1管作空白对照，在波长510nm处测各试管中溶液的吸光度（1号做空白），以吸光度为纵坐 标，浓度为横坐标，绘制出标准曲线，并得到回归方程。葡聚糖标准曲线的测定结果（2）样品含量的测定取1.0ml样品液于10.0容量瓶中，加30%乙醇至5mL,加5%亚硝酸钠溶 液0.3 mL，摇匀；放置6min，加10%硝酸铝溶液0.3mL,摇匀；再放置6 min， 加4%氢氧化钠溶液2mL，加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，在波长510nm 处测吸光度。代入线性回归方程，算出黄酮提取液中黄酮的质量浓度。银杏叶总黄酮提取率（）=提取物所含黄铜质量（g）/银杏叶质量 （g）X100%5. 实验结果与分析
银杏叶提取黄酮及分离纯化
