疟原虫检验技术

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1、 疟原虫检验技术疟原虫检验技术 -血片制作、染色及疟原虫形态鉴别血片制作、染色及疟原虫形态鉴别贵州省疾控中心地病所贵州省疾控中心地病所卢 丽 丹 寄生人体的四种疟原虫寄生人体的四种疟原虫间日疟原虫间日疟原虫 P.vivaxP.vivax，P.vP.v 恶性疟原虫恶性疟原虫 P PFalciparum,P.fFalciparum,P.f 三日疟原虫三日疟原虫 P PMalariae,P.mMalariae,P.m 卵形疟原虫卵形疟原虫 P POvale,P.oOvale,P.o 我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另二种少见，近年偶见国外输入病例。二种少见，近年

2、偶见国外输入病例。其它疟原虫 诺氏疟原虫诺氏疟原虫(Plasmodium nowlesi)内容提纲内容提纲血片制作与染色血片制作与染色疟原虫计数疟原虫计数疟原虫的基本形态特征疟原虫的基本形态特征血片制作血片制作第一步：第一步：载玻片的清洗载玻片的清洗用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，清水用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，清水冲洗后凉干，浸于冲洗后凉干，浸于95%95%的乙醇中的乙醇中1 1小时以上小时以上用绸布擦干置干燥环境中保存。用绸布擦干置干燥环境中保存。第二步：患都信息的核实采集血样涂片时，首先要核对患者的姓名和年龄并在玻片的右侧编号第三步：采集血样第三步：采集血样 采血部位：采血部位：耳垂

3、耳垂或无名指，或无名指，取血方法：取血方法：通常在耳垂取血，通常在耳垂取血，先用先用75%75%酒精棉球消毒取血部位酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小膜血量约一粒米大小,薄血膜血薄血膜血量为厚血膜的一半或量为厚血膜的一半或1/31/3。厚血膜厚血膜 用推片的一角，从取用推片的一角，从取血部位刮取约血部位刮取约4 4微升血量微升血量（相

4、当于火柴头大小），（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向触，再由里向外一个方向旋转，转旋转，转2424圈，涂成直圈，涂成直径径0.810.81厘米大小圆形厚厘米大小圆形厚血膜血膜薄血膜薄血膜再取一小滴血再取一小滴血.将血置将血置于第一张玻片离厚血膜适于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方当远的地方.将将 推片的边推片的边缘紧贴载玻片，轻轻上下缘紧贴载玻片，轻轻上下移动，使血液沿边缘散开，移动，使血液沿边缘散开，然后匀速地向前推进，形然后匀速地向前推进，形成薄而平铺的薄血膜成薄而平铺的薄血膜第四步：血片制作第四步：血片制作厚血膜薄血膜制片过程图示标签

5、标准的疟疾厚薄血膜片标准的疟疾厚薄血膜片标签厚血膜血量不宜过多或过少薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列血片的制作血片制作影响因素血片制作影响因素载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；厚血膜厚度以一个油镜视野内可见厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-105-10个白细胞为宜；个白细胞为宜；血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇等舔食血膜；等舔食血膜；制成的血片在未

6、干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果血片染色血片染色 两种染色方法:吉氏染色法 1.染色原液配制 2.门诊快染、慢染 3.成批染色和溶血染色 瑞氏染色法 WHO推荐使用吉氏染色法吉氏染液吉氏染液(原液原液)的配置的配置 吉氏染粉吉氏染粉 (Azure B type)5g 甘油甘油 (纯纯)250ml 甲醇甲醇 (纯纯)250ml吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在直至

7、甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤经过滤即可使用。保即可使用。保存时间越长染色效果越好。存时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于整个染色液配制时间不能少于5 5个小时个小时血片染色第一步：第一步：薄血膜薄血膜的固定的固定u厚血膜充分干燥,用甲醇固定薄血膜，平放待干（要点：甲醇不能触

8、碰到厚血膜）血片的染色血片的染色第二步：染色用水和冲洗用水配制u常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水u用pH7.0pH7.2的缓冲液。u操作操作1 1（快染）（快染）量筒内量筒内量量2ml2ml缓冲液缓冲液(PBSPH7.0)(PBSPH7.0)或净水，直接滴加吉氏原或净水，直接滴加吉氏原液液7 7滴，混匀，滴入待染标滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色本的厚薄血膜上，染色10min10min，清水缓缓冲洗，晾，清水缓缓冲洗，晾干干（血膜朝内面）（血膜朝内面）镜检。镜检。u操作操作2 (2 (慢染慢染)量筒量筒内量内量2ml2ml缓冲液或净水，缓冲液或净水，再滴加吉氏原液再滴加吉氏原液4

9、4滴，混匀滴，混匀，滴入待染标本上，染色，滴入待染标本上，染色30min30min。清水缓缓冲洗，晾。清水缓缓冲洗，晾干镜检。干镜检。第三步：血片染色将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，染色30分钟。（如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。u成批血片染色厚血膜溶血染色放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。质量好的染

10、色质量好的染色 显微镜下核呈红色显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列 如果血片偏红如果血片偏红,说明染液偏酸性说明染液偏酸性如果血片偏蓝如果血片偏蓝,说明染液偏硷性说明染液偏硷性外观吉氏染色血片偏 酸偏 碱标 准配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量于提高镜检质量；染液稀释后使用时间：染液稀释后使用时间：原液必须临用时稀释，随原液必须临用时稀释，随配随用；配随用；染液的稀释浓度；染液的稀释浓度；染色时间。染色时间。染色质量影响因素染色质量影响因素l用水过酸，用水过酸，可致感可致

11、感染的染的RBCRBC上的点彩上的点彩染不出来；染不出来；l用水过碱，用水过碱，则使薄则使薄血膜上的血膜上的RBCRBC染成染成灰蓝色，致使灰蓝色，致使R R的的胞浆难以辨论。胞浆难以辨论。染色染色稀释稀释用水用水:PH7.0-7.2清洁水清洁水。染色质量影响因素染色质量影响因素固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜；固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜；血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏天不超过天不超过4848小时，冬天也不能超过小时，冬天也不能超过7272小时小时,放置放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差

12、。染色质量影响因素染色质量影响因素疟原虫镜检 疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 疟原虫密度计数方法 人体四种疟原虫的形态特征当前分子生物学、血清学技术快速发展当前分子生物学、血清学技术快速发展,但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的代的确诊疟疾的 “金标准金标准”显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴别别4 4种人体疟原虫种人体疟原虫原虫镜检-金标准疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 厚血膜 薄血膜 优点优点血量多，面积小，血量多，面积小，原虫原虫检出率高检出率高经甲醇固定，红细胞完经甲醇固定，红细胞完整，原虫形态改变不大，整，原虫

13、形态改变不大，原虫易于辨认原虫易于辨认 缺点缺点原虫在干燥过程中皱缩，原虫在干燥过程中皱缩，红细胞消失，原虫变形较红细胞消失，原虫变形较大，大，原虫鉴定困难原虫鉴定困难血量比厚血膜少许多，血量比厚血膜少许多，但面积是厚血膜的但面积是厚血膜的8-108-10倍。检查费时，倍。检查费时，原虫检原虫检出率较低出率较低用途用途用于疟疾病人检查用于疟疾病人检查原虫虫种、虫期鉴定及原虫虫种、虫期鉴定及初学者教学标本初学者教学标本疟原虫密度计算疟原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法：计算疟原虫密度的三种方法：白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法(厚血膜厚血膜 WHO)WHO)优点：可作为定性和定量分析优

14、点：可作为定性和定量分析 半定量计数法半定量计数法 (厚血膜厚血膜)优点：方法简便优点：方法简便 缺点：只能定性，不宜作为定量分析缺点：只能定性，不宜作为定量分析 红细胞感染密度计算法红细胞感染密度计算法(薄血膜薄血膜)白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法镜检厚血膜，按视野顺序，记录镜检厚血膜，按视野顺序，记录200200个白细胞中的个白细胞中的疟原虫数，如果原虫密度较低（疟原虫数，如果原虫密度较低（200200个白细胞中小个白细胞中小于于100100个疟原虫），可增加白细胞，计数个疟原虫），可增加白细胞，计数500500个。个。密度单位密度单位:原虫数原虫数/l/l计算公式：疟原虫数计算

15、公式：疟原虫数 计数的白细胞数计数的白细胞数 患者患者每微升血白细胞数每微升血白细胞数 =疟原虫数疟原虫数/l/l血。血。如果不知患者的白细胞数，则每微升血以如果不知患者的白细胞数，则每微升血以80008000个个白细胞计数白细胞计数(国际标准国际标准)。白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法从血膜的左上角开始，横向。从血膜的左上角开始，横向。计数计数1 1个视野后，每次间隔个视野后，每次间隔5 5个视野个视野,再计数再计数。厚血膜厚血膜白细胞疟原虫计数法白细胞疟原虫计数法例如例如 计数计数200 WBC200 WBC中有中有3535个疟原虫，在不知患个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，

16、以每微升血者白细胞数的情况下，以每微升血8 0008 000个白细个白细 胞计数胞计数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（计数的疟原虫数）200（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数）=1400/l答：该患者的疟原虫密度为1400/l。用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估算出疟原虫密度。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野15个虫，记录“”4.平均每个视野6 10个虫，记录“+”5.平均每个视野11 100个虫，

17、记录“+”6.平均每个视野100个虫以上，记录“+”。如：Pv R+T+G少 这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。半定量计数法如何确定疟原虫血片为阴性 检查全部厚血膜视野未查见疟原虫 最少检查100个厚血膜视野未查见 疟原虫（临床病人）人体四种疟原虫的分布人体四种疟原虫的分布疟原虫镜检感染人的疟原虫有四种感染人的疟原虫有四种:恶性疟原虫恶性疟原虫 P.P.falciparumfalciparum间日疟原虫间日疟原虫 P.P.vivaxvivax三日疟原虫三日疟原虫 P.P.malariaemalariae 卵形疟原虫卵形疟原虫 P.P.ovaleoval

18、e 恶性疟恶性疟 P.falciparumP.falciparum 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 我国流行区域为云南省和海南省我国流行区域为云南省和海南省 四种疟原虫中致病力最强四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者，无免疫力者 感染后出现急性症状感染后出现急性症状,不及时治疗可不及时治疗可危及危及生命（脑型疟）生命（脑型疟）间日疟间日疟 P.vivaxP.vivax 间日疟原虫分布于我国大部分地区间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中主要是中部地区部地区 病程良性病程良性,有复发有复发 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲，特别是西非则很少见三日

19、疟三日疟 P.malariaeP.malariae 遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布印度部分地区，呈片状、块状分布三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告卵形疟卵形疟 （蛋形疟）（蛋形疟）P.ovaleP.ovale主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告在我国已基本消灭在我国已基本消灭 原虫镜检血细胞红细胞血小板白细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）红细胞红细胞是

20、双面凹的圆饼状边缘较厚，而中间较薄血小板各种血细胞模式图 1.红细胞 2.嗜酸性粒细胞 3.嗜碱性粒细胞 4.中性粒细胞 5.淋巴细胞 6.单核细胞 7.血小板 1234567疟原虫的基本形态特征疟原虫的基本形态特征疟原虫基本构造为细胞质疟原虫基本构造为细胞质(胞浆胞浆)、核和疟色素、核和疟色素；原虫：原虫：经吉氏或瑞氏染色：核呈红色，胞质呈经吉氏或瑞氏染色：核呈红色，胞质呈兰色，疟色素为本色；兰色，疟色素为本色；细胞浆：细胞浆：蓝色或深蓝色，随着虫体发育长蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多大，细胞浆逐渐增多；核：核：呈鲜红色，呈圆形或椭圆形。核的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏

21、松，例如间日疟原虫雄配子体的核。核核胞浆胞浆斑点斑点疟色素：疟色素：不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。类而异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。间日疟原虫：呈短棒状，黄褐色；间日疟原虫：呈短棒状，黄褐色；恶性疟原虫：呈细砂状，黑褐色；恶性疟原虫：呈细砂状，黑褐色；三日疟原虫：呈砂粒状，深褐色；三日疟原虫：呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫：与间日疟原虫相似。卵形疟原虫：与间日疟原虫相似。疟原虫的基本形态特征疟原虫的基本形态特征疟色素疟色素红细胞不涨大红细胞不涨大环状体纤细环状体纤细,常有多常有多重感染，环状体内重感染

22、，环状体内可有可有2 2个核个核 环状体可贴在红细环状体可贴在红细胞边缘胞边缘 除环状体，配子体除环状体，配子体外没有其他发育期外没有其他发育期配子体呈新月形或配子体呈新月形或腊肠形腊肠形成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含16-16-3232个裂殖子，排列个裂殖子，排列不规则不规则可出现茂氏点可出现茂氏点恶性疟（恶性疟（P.falciparum）鉴定要点鉴定要点21.A member of the UN forces in East Timor.Presented with high temperature.1.红细胞明显涨大 2.薛氏点明显 3.成熟环状体粗大4.滋养体胞浆有阿米巴样伪足5.血片中

23、可见各期的原虫形态6.成熟裂殖体约含12-24个裂殖子 间日疟（P.vivax）鉴定要点2.Intermittent fever;arrived from India 2 months ago.红细胞不涨大或略小红细胞不涨大或略小环状体中等大小，核较大环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚，胞浆粗厚胞浆不活跃呈带状形成熟胞浆不活跃呈带状形成熟滋养体呈滋养体呈菊花状菊花状,内含内含6-126-12个裂殖子个裂殖子雌雄配子体小于正常红细雌雄配子体小于正常红细胞，色素呈深褐色胞，色素呈深褐色常可查见各阶段的疟原虫常可查见各阶段的疟原虫三日疟（三日疟（P.malariae）诊断要点诊断要点卵形疟（P.ova

24、le）鉴定要点1.红细胞正常或略涨大 2.常见慧星状(也称齿轮状)3.环粗大 4.薛氏点明显 5.成熟滋养体类似三日疟原虫但更粗大6.成熟裂殖体约含6-12个裂殖子 18.Recent trip to Southern India-headaches and vaguely unwell.类型周 围 血中 发 育阶段红细胞形态疟原虫形态大小点彩胞浆疟色素裂殖子数恶性疟原虫环状体配子体正 常 大小茂 氏点小滋养体纤细，常见个核，一个红细胞内常有2个以上的原虫粗黑，配子体中明显16-32间日疟原虫各 期 滋养体裂殖体配子体涨大,可达 正 常的 1.5-2 倍薛 氏点阿米巴样滋养体，浅蓝色，活泼金棕

25、色不明显12-24卵形疟原虫各期均有正 常 大小 或 略涨大,薛 氏点卵圆形滋养体，蓝色较深，核较大深棕色明显6-12三日疟原虫各期均有裂殖体正常或略缩小齐氏点（西门氏）但少见圆形，蓝色深，核紧缩，滋养体胞浆呈带状深棕色，粗明显6-1 2混合感染的鉴别混合感染的鉴别容易鉴别的混合感染容易鉴别的混合感染1 1）同一血膜中发现间日疟各期原虫和恶性疟）同一血膜中发现间日疟各期原虫和恶性疟雌雄配子体。雌雄配子体。2 2）同一血膜中发现大量纤细的恶性疟环状体）同一血膜中发现大量纤细的恶性疟环状体，并混有少量间日疟原虫。，并混有少量间日疟原虫。不易鉴别的混合感染不易鉴别的混合感染1 1）间日疟各期原虫和粗

26、环的恶性疟环状体。）间日疟各期原虫和粗环的恶性疟环状体。2 2）仅有间日疟和恶性疟的环状体。）仅有间日疟和恶性疟的环状体。厚血膜中容易被误认为疟原虫的物质 未成熟的网织红细胞溶血后的残影易被误为薛氏点 重叠的血小板易被误为裂殖体 混杂在稀释液中的细菌、植物孢子、酵母、花粉、藻类等很像血液中的多种寄生虫，如血孢子虫等，会干扰对疟原虫的鉴别。读 片 练 习4.Unspecified overseas travel.Presented with temperature 38.4C 3.History of round the world safari including S.America,Asia and Africa.General malaise.谢 谢！