生物化学分析：第3章 酶分析法

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1、第三章第三章 酶分析法酶分析法3-1 酶分析法概述（酶分析法概述（1）酶的定义：酶的定义：活细胞产生的，具有催化功能的特殊物质。除极个别活细胞产生的，具有催化功能的特殊物质。除极个别可催化自身反应的核酶（可催化自身反应的核酶（RNA）外，其余所有的酶都是蛋白质。）外，其余所有的酶都是蛋白质。酶催化反应的特点酶催化反应的特点（与化学催化剂相比）：（与化学催化剂相比）：酶来源于生物体，酶来源于生物体，至今无法合成获得；至今无法合成获得；所需催化条件温和（常温、常压及中性所需催化条件温和（常温、常压及中性pH），但自身易变性失活；），但自身易变性失活；高催化效率（化学催化剂的高催化效率（化学催化剂的

2、107-1013倍）；倍）；高特异性（绝对、相对、立体结构特异性）高特异性（绝对、相对、立体结构特异性）酶与生命活动相关，生物体内一切生化反应都需要酶的催化才能酶与生命活动相关，生物体内一切生化反应都需要酶的催化才能进行！因此，酶学研究在生产实践及基础理论方面，都起着非常进行！因此，酶学研究在生产实践及基础理论方面，都起着非常重要的作用。重要的作用。3-1 酶分析法概述（酶分析法概述（2）酶的应用酶的应用用以制造某些产品：例如酶法生产可的松，用凝乳酶制造乳酪用以制造某些产品：例如酶法生产可的松，用凝乳酶制造乳酪用以去除某些物质：如脂肪酶除去脂类污物；果胶酶澄清果汁用以去除某些物质：如脂肪酶除去

3、脂类污物；果胶酶澄清果汁用以识别某种物质；用以识别某种物质；用以测定某种物质。用以测定某种物质。属属酶法分析范畴，是酶学研究中的重要内容，也是目前发展酶法分析范畴，是酶学研究中的重要内容，也是目前发展较为迅速的一个领域。酶分析法已成为一项公认的分析技术。较为迅速的一个领域。酶分析法已成为一项公认的分析技术。3-1 酶分析法概述（酶分析法概述（3）酶分析法的类型酶分析法的类型以以“酶酶”为分析对象为分析对象，测定的是样品的酶含量或活力，这类分析，测定的是样品的酶含量或活力，这类分析方法称为方法称为“酶活力测定酶活力测定”。以以“酶酶”为分析试剂为分析试剂，测定样品中用一般化学方法难于检测的物，测

4、定样品中用一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅助因子等，这类分析方法称质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅助因子等，这类分析方法称为为“酶法分析酶法分析”。两者检测对象虽不同，但原理和方法一致。不同之处在于：两者检测对象虽不同，但原理和方法一致。不同之处在于：“酶酶活力测定活力测定”中酶含量是决定酶催化反应速度的唯一因素；而在中酶含量是决定酶催化反应速度的唯一因素；而在“酶酶法分析法分析”中被测物质才是限制反应的因素。中被测物质才是限制反应的因素。3-1 酶分析法概述（酶分析法概述（4）酶法分析的特点酶法分析的特点特异性强、干扰少特异性强、干扰少，可直接对复杂体系中的待测组

5、分进行测定，可直接对复杂体系中的待测组分进行测定方法灵敏度高，一般可达方法灵敏度高，一般可达10-7 10-9 mol/L反应条件温和（污染很少），速度快（通常可在反应条件温和（污染很少），速度快（通常可在30 min内完成）内完成）酶及样品用量少，方法经济且适合样品量较少的生物样品的测定酶及样品用量少，方法经济且适合样品量较少的生物样品的测定精确度一般，方法简便程度较差（对操作要求较高）精确度一般，方法简便程度较差（对操作要求较高）仅限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定，有一定局限性仅限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定，有一定局限性 3-1 酶分析法概述（酶分析法概述（5）酶分析法

6、迅速发展的原因：酶分析法迅速发展的原因：酶工业的发展酶工业的发展，可方便获得各种酶制剂；，可方便获得各种酶制剂；酶固定化技术的快速发展酶固定化技术的快速发展，使酶的反复和连续使用成为可能；，使酶的反复和连续使用成为可能；（固定化酶既能与自动化测定技术结合，促进酶自动化分析法的普（固定化酶既能与自动化测定技术结合，促进酶自动化分析法的普及；又可使酶的使用简便化，如制成含酶试纸或酶试剂包）及；又可使酶的使用简便化，如制成含酶试纸或酶试剂包）酶分析法在临床诊断、食品加工和发酵等方面被广泛应用酶分析法在临床诊断、食品加工和发酵等方面被广泛应用。如葡。如葡萄糖氧化酶测定血糖、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶测定

7、血清中的总萄糖氧化酶测定血糖、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶测定血清中的总胆固醇是临床检验中常用的方法；某些酶的含量也是临床诊断的重胆固醇是临床检验中常用的方法；某些酶的含量也是临床诊断的重要指标，如血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆碱酯酶等。要指标，如血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆碱酯酶等。3-1 酶分析法概述（酶分析法概述（6）酶在生化分析中应用的发展趋势：酶在生化分析中应用的发展趋势：单细胞和亚细胞水平上的酶分析法单细胞和亚细胞水平上的酶分析法 小型化及高选择性的分离手段：毛细管电泳和毛细管电色谱小型化及高选择性的分离手段：毛细管电泳和毛细管电色谱 高灵敏的测定方法：激光诱导荧光、安培法等

8、高灵敏的测定方法：激光诱导荧光、安培法等酶作为标记物的分析作用酶作为标记物的分析作用 广泛用于免疫分析、核酸分子杂交等领域（广泛用于免疫分析、核酸分子杂交等领域（相关章节相关章节）模拟酶（人工酶）分析模拟酶（人工酶）分析 a.对酶活性中心功能团的模拟：金属卟啉衍生物模拟含血红素酶对酶活性中心功能团的模拟：金属卟啉衍生物模拟含血红素酶 b.酶作用方式的模拟：含咪唑、羟基、巯基等官能团的胶束酶作用方式的模拟：含咪唑、羟基、巯基等官能团的胶束 c.抗体酶：以催化反应过渡态的类似物作为半抗原制备催化抗体抗体酶：以催化反应过渡态的类似物作为半抗原制备催化抗体3-2 酶及酶催化反应酶及酶催化反应2-2-1

9、 酶催化反应的类型及命名酶催化反应的类型及命名2-2-2 酶的分子结构与功能酶的分子结构与功能2-2-3 酶促反应的机理酶促反应的机理2-2-4 酶促反应动力学酶促反应动力学3-2-1 酶催化反应的类型及命名酶催化反应的类型及命名酶催化的反应类型酶催化的反应类型 分为氧化还原、转移、水解、裂合、异构化、连接六大类分为氧化还原、转移、水解、裂合、异构化、连接六大类酶的编号酶的编号 EC：Enzyme Commision W：催化反应的类型催化反应的类型 X：亚类，指出底物及基团亚类，指出底物及基团 Y：亚亚-亚类，指出特殊的底物或辅酶亚类，指出特殊的底物或辅酶 Z：亚亚-亚类中的编号，与发现早晚

10、及来源有关亚类中的编号，与发现早晚及来源有关酶的命名：酶的命名：习惯命名和系统命名习惯命名和系统命名Z.Y.X.W.EC 一些酶的命名举例一些酶的命名举例编号编号推荐名称推荐名称系统命名系统命名催化的反应催化的反应EC1.4.1.3谷氨酸谷氨酸脱氢酶脱氢酶L-谷氨酸：谷氨酸：NAD-氧化还原酶氧化还原酶L-谷氨酸谷氨酸+H2O+NAD+酮戊二酸酮戊二酸+NH3+NADHEC2.6.1.1天冬氨酸天冬氨酸氨基转移酶氨基转移酶L-天冬氨酸：天冬氨酸：酮戊二酸酮戊二酸氨基转移酶氨基转移酶L-天冬氨酸天冬氨酸+酮戊二酸酮戊二酸草酰乙酸草酰乙酸+L-谷氨酸谷氨酸EC3.5.3.1精氨酸酶精氨酸酶L-精氨

11、酸精氨酸脒基水解酶脒基水解酶L-精氨酸精氨酸+H2OL-鸟氨酸鸟氨酸+尿素尿素EC4.1.2.13果糖二磷酸果糖二磷酸醛缩酶醛缩酶D-果糖果糖1,6二磷酸：二磷酸：D-甘油醛甘油醛3-磷酸裂合酶磷酸裂合酶D-果糖果糖1,6二磷酸二磷酸磷酸二羟丙磷酸二羟丙酮酮+D-甘油醛三磷酸甘油醛三磷酸EC5.3.1.9磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖异构酶异构酶D-葡萄糖葡萄糖6-磷酸磷酸酮醇异构酶酮醇异构酶D-葡萄糖葡萄糖6-磷酸磷酸 D-果糖果糖6-磷酸磷酸EC6.3.1.2谷氨酰胺谷氨酰胺合成酶合成酶L-谷氨酸：氨连接酶谷氨酸：氨连接酶ATP+L-谷氨酸谷氨酸+NH3 ADP+L-谷氨酰胺谷氨酰胺+磷酸磷酸3-2

12、-2 酶的分子结构与功能（酶的分子结构与功能（1）酶的不同形式酶的不同形式单体酶单体酶（monomeric enzyme）：仅含一个多肽链）：仅含一个多肽链寡聚酶寡聚酶（oligomeric enzyme）：含二个以上的相同或不同的多肽）：含二个以上的相同或不同的多肽链（亚基）链（亚基）多酶体系多酶体系（multienzyme system）：由几种不同功能的酶彼此聚）：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物合形成的多酶复合物多功能酶多功能酶（multifunctional enzyme）：一些多酶体系在进化过）：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，使得多种不同催化功能融于一条多肽链中

13、程中由于基因的融合，使得多种不同催化功能融于一条多肽链中3-2-2 酶的分子结构与功能（酶的分子结构与功能（2）酶的分子组成酶的分子组成单纯酶（单纯酶（simple enzyme）结合酶（结合酶（conjugated enzyme）全酶全酶（holoenzyme）蛋白质部分：酶蛋白（蛋白质部分：酶蛋白（apoenzyme）辅助因子（辅助因子（confactor）小分子有机化合物小分子有机化合物金属离子金属离子胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶单纯酶单纯酶。分子量。分子量2.5万，含万，含245个个AA残基。第残基。第57位组氨位组氨酸、酸、102位天冬氨酸、位天冬氨酸、195位位丝氨酸等三个残基在催化作

14、丝氨酸等三个残基在催化作用中起着中心作用。主要是用中起着中心作用。主要是剪切芳香族氨基酸：色氨酸、剪切芳香族氨基酸：色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基端苯丙氨酸或酪氨酸的羧基端形成的肽键。形成的肽键。羧肽酶羧肽酶A含金属离子的结合酶含金属离子的结合酶。具有具有307个个AA的单链，的单链，其中紧密结合着一个其中紧密结合着一个Zn2+。145位精氨酸、位精氨酸、248位酪氨酸、位酪氨酸、270的谷的谷氨酸和氨酸和Zn2+构成活性中构成活性中心心。作用是水解有芳香。作用是水解有芳香族和中性脂肪族氨基酸族和中性脂肪族氨基酸形成的羧基末端。形成的羧基末端。2Zn含血红素酶含血红素酶AANNNNCOOHCO

15、OHFeFeApoproteinActive Site Amino AcidsPositioning of the substrateAssistedCatalysisProximal ligand of the iron:Cysteinate in cytochromes P450histidine in hemoglobin,peroxidaseHemeRedox reactionsOxene transfer(cytochromes P450)Electron transfer(peroxidases)Substration binding or active site含小分子辅基的结合

16、酶含小分子辅基的结合酶，是具有氧化还原性质的是具有氧化还原性质的一大类酶，包括过氧化一大类酶，包括过氧化氢酶、过氧化物酶和细氢酶、过氧化物酶和细胞色素胞色素P450等，血红蛋等，血红蛋白和肌红蛋白也具有类白和肌红蛋白也具有类似结构。其所含小分子似结构。其所含小分子辅基为氯化血红素（铁辅基为氯化血红素（铁卟啉化合物）卟啉化合物）3-2-2 酶的分子结构与功能（酶的分子结构与功能（3）结合酶各部分在催化反应中的作用结合酶各部分在催化反应中的作用酶蛋白决定反应的特异性酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质辅助因子决定反应的种类与性质金属离子的作用：金属离子的作用：稳定酶构象；参与催化反应

17、，传递电子；在酶蛋稳定酶构象；参与催化反应，传递电子；在酶蛋白与底物间起桥梁作用，中和阴离子，降低反应中静电斥力等白与底物间起桥梁作用，中和阴离子，降低反应中静电斥力等小分子有机化合物的作用：小分子有机化合物的作用：在反应中起运载体的作用，传递电子、在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团质子或其它基团3-2-2 酶的分子结构与功能（酶的分子结构与功能（4）辅助因子的分类辅助因子的分类 按与酶蛋白的结合紧密程度，可辅助因子将其分为：按与酶蛋白的结合紧密程度，可辅助因子将其分为：辅酶辅酶coenzyme：与酶蛋白结合疏松、可通过透析或超滤的方式除去与酶蛋白结合疏松、可通过透析或超滤的方式

18、除去辅基辅基prosthetic group：与酶蛋白结合紧密、不可以通过透析或超滤的方与酶蛋白结合紧密、不可以通过透析或超滤的方式直接将其除去式直接将其除去金属酶金属酶metalloenzyme：金属离子与酶结合紧密，提取酶时不易丢失金属离子与酶结合紧密，提取酶时不易丢失金属激活酶金属激活酶metal-activated enzyme：金属离子为酶的活性所必需，但与金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。酶的结合不甚紧密。小分子有机化合物在催化反应中的作用小分子有机化合物在催化反应中的作用转移的基团转移的基团小分子有机化合物（辅酶或辅基）小分子有机化合物（辅酶或辅基）名称名称所含的维

19、生素所含的维生素氢原子氢原子（质子）（质子）NAD+（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I）NADP+（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II）FMN（黄素单核苷酸）（黄素单核苷酸）FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）（黄素腺嘌呤二核苷酸）尼克酰胺尼克酰胺尼克酰胺尼克酰胺维生素维生素B2维生素维生素B2醛基醛基TPP（焦磷酸硫胺素）（焦磷酸硫胺素）维生素维生素B1酰基酰基辅酶辅酶A（CoA）硫辛酸硫辛酸泛酸泛酸硫辛酸硫辛酸烷基烷基钴胺素辅酶类钴胺素辅酶类维生素维生素B12二氧化碳二氧化碳生物素生物素生物素生物素氨基氨基磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛吡哆醛吡

20、哆醛3-2-2 酶的分子结构与功能（酶的分子结构与功能（5）酶的活性中心：酶的活性中心：又称作活性部位（又称作活性部位（active site），指必需基团），指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。底物特异结合并将底物转化为产物。活性中心内部的必需基团活性中心内部的必需基团 结合基团：与底物结合结合基团：与底物结合 催化基团：催化底物转变为产物催化基团：催化底物转变为产物活性中心外部的必需基团活性中心外部的必需基团 位于活性中心以外，维持酶活性位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空

21、间构象所必需。中心应有的空间构象所必需。对于需要辅酶的酶，辅酶往往就对于需要辅酶的酶，辅酶往往就是活性中性的组成部分是活性中性的组成部分活性中心的共同特点：活性中心的共同特点：活性中心仅占酶整体的一小部分活性中心仅占酶整体的一小部分，即酶分子中大多数残基并不与，即酶分子中大多数残基并不与底物接触；底物接触；活性中心是一个三维实体活性中心是一个三维实体，由来自氨基酸序列上的不同部位的残，由来自氨基酸序列上的不同部位的残基所组成；基所组成；酶的三维活性中心是裂缝或裂隙酶的三维活性中心是裂缝或裂隙，常是一个疏水的环境，底物就，常是一个疏水的环境，底物就存在于这样的环境中；存在于这样的环境中；底物与酶

22、之间是以一种弱的力结合在一起（底物与酶之间是以一种弱的力结合在一起（12.5 50 kJ/mol）；）；y结合的专一性取决于活性中心部位中原子的确定排布方式，即底结合的专一性取决于活性中心部位中原子的确定排布方式，即底物应具有与其相匹配的外形。物应具有与其相匹配的外形。溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心结合基团结合基团：色氨酸：色氨酸62、63、108和天冬氨酸和天冬氨酸101催化基团：催化基团：谷氨酸谷氨酸35和和天冬氨酸天冬氨酸52A F是底物多糖链的糖是底物多糖链的糖基，位于酶活性中心形基，位于酶活性中心形成的裂隙中。成的裂隙中。633-2-3 酶促反应的机理（酶促反应的机理（1）酶酶-底

23、物复合物底物复合物“诱导契合假说诱导契合假说”（induce-fit hypothesis）PEESSE 酶与底物相互接近时，其酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶合。这一过程称为酶-底物底物结合的诱导契合假说。结合的诱导契合假说。E:酶；酶；S:底物；底物；P:产物产物ES:酶酶-底物复合物底物复合物底物复合物底物复合物酶酶-底物底物酶酶诱导契合诱导契合己糖激酶结合底物前后的己糖激酶结合底物前后的x-射线衍射分析射线衍射分析ecosgluD binding glucose Before binding

24、 glucosefter AThe induced conformational change in hexokinase（shows x-ray diffraction studies of the enzyme hexokinase羧肽酶结合底物前后的羧肽酶结合底物前后的x-射线衍射分析射线衍射分析Arg145Glu270Tyr2483-2-3 酶促反应的机理（酶促反应的机理（2）酶高催化活性的原因酶高催化活性的原因诱导契合：诱导契合：酶活性中心的化学结构，诱使底物的化学键变形或极化，酶活性中心的化学结构，诱使底物的化学键变形或极化，提高了底物基态的能量，使其具有更高的活性；提高了底物基态

25、的能量，使其具有更高的活性；接近效应：接近效应：结合基团与对底物的固定化作用，使其与参与反应的基团结合基团与对底物的固定化作用，使其与参与反应的基团接近，大大提高了活性中心区域底物及催化基团的浓度，使反应类似于接近，大大提高了活性中心区域底物及催化基团的浓度，使反应类似于分子内反应，反应速率远高于分子间反应；分子内反应，反应速率远高于分子间反应；定向效应：定向效应：使底物正确而有利的定向，反应时键只最小程度的移动或使底物正确而有利的定向，反应时键只最小程度的移动或旋转，活性中心合适的电荷分布几何形状也有利于反应活化能的降低；旋转，活性中心合适的电荷分布几何形状也有利于反应活化能的降低；多功能基

26、团间的协同催化作用多功能基团间的协同催化作用：酸碱催化、共价催化、活性中心的微：酸碱催化、共价催化、活性中心的微环境、金属离子的作用等。环境、金属离子的作用等。3-2-4 酶促反应动力学酶促反应动力学 研究内容：研究内容：研究各种影响因素（如研究各种影响因素（如底物浓度底物浓度、活性酶的浓度、温度、活性酶的浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述激活剂和抑制剂等）对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述研究意义研究意义 指导选择底物种类、确定底物浓度，最适温度、最适指导选择底物种类、确定底物浓度，最适温度、最适pH、激活、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定

27、酶活性或相关物质浓度剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性或相关物质浓度研究一种因素影响时，其它因素均固定（单因素变化法）研究一种因素影响时，其它因素均固定（单因素变化法）时时间间产产物物浓浓度度斜率斜率时间时间浓度浓度 /v3-2-4-1 底物浓度对反应速率的影响（底物浓度对反应速率的影响（1）研究前提研究前提单底物、单产物反应；单底物、单产物反应；酶促反应的速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的酶促反应的速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示；消耗量或产物的生成量来表示；反应速度取其反应速度取其初速度初速度，即底物的消耗量很小（一般在，即底物的

28、消耗量很小（一般在5%以内）时以内）时的反应速度；的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度；底物浓度远远大于酶浓度；其它因素不变的情况下，底物浓度对反应速度呈其它因素不变的情况下，底物浓度对反应速度呈矩形双曲线矩形双曲线关系关系3-2-4-1 底物浓度对反应速率的影响（底物浓度对反应速率的影响（2）Skv 反应速率不在成反应速率不在成比例加速，反应比例加速，反应为混合级反应为混合级反应maxVv 一级反应一级反应混合级反应混合级反应零级反应零级反应 SV酶反应速率与底物浓度的关系酶反应速率与底物浓度的关系3-2-4-1 底物浓度对反应速率的影响（底物浓度对反应速率的影响（3）米凯利斯米凯利斯-门顿动

29、力学方程：门顿动力学方程：1913年年Michaelis和和Menten提出反应提出反应速度与底物浓度关系的数学方程，即米速度与底物浓度关系的数学方程，即米-门氏方程，简称门氏方程，简称米氏方程米氏方程 SkSvvmmax v：不同底物浓度时的反应速率；：不同底物浓度时的反应速率；S：底物浓度：底物浓度vmax：最大反应速率；：最大反应速率；km：米氏常数：米氏常数米氏方程的两个假设：米氏方程的两个假设：E与与S形成形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为分解为E及及P的的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即v=k3ES

30、S的总浓度远远大于的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓的浓度可认为不变即度可认为不变即S=St（初始浓度），（初始浓度），而而 E+ES =Et PEESSE 米氏方程的推导米氏方程的推导 ESkESk32 ES的生成速度：的生成速度：ES的解离速度：的解离速度：SESEkt1 1k2k4k 3k酶反应体系处于动态平衡时，两者速率相同，酶反应体系处于动态平衡时，两者速率相同，ES保持动态稳定保持动态稳定 ESkESkSESEk32t1 132tkkkESSESE SKSE ES mt mk 3k 3k SkSEkvmt3 SkSvvmmax

31、3-2-4-1 底物浓度对反应速率的影响（底物浓度对反应速率的影响（4）Km是酶学研究中一个极为重要的数据，在数值上等于酶促反应速是酶学研究中一个极为重要的数据，在数值上等于酶促反应速率率v为最大反应速率为最大反应速率vmax一半时对应的底物浓度，单位为一半时对应的底物浓度，单位为mol/L。Km的意义：的意义：酶的特征常数之一其大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关酶的特征常数之一其大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关（但与测定条件如底物、温度、（但与测定条件如底物、温度、pH值有关），可用于酶的鉴别；值有关），可用于酶的鉴别；反映酶对底物亲和力大小，可用于选择酶的最适或天然底物反映酶对底物亲

32、和力大小，可用于选择酶的最适或天然底物 其他意义：计算不同底物浓度时的反应程度；判断可逆反应的速其他意义：计算不同底物浓度时的反应程度；判断可逆反应的速率；判断酶偶联反应的限速反应；计算工具酶的用量等等率；判断酶偶联反应的限速反应；计算工具酶的用量等等 SkSkSv2vvmmmaxmax maxv2/vmaxmk S几种酶的几种酶的km值值酶酶底物底物Km/mol/L溶菌酶溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺6 10-6青霉素酶青霉素酶卞基青霉素卞基青霉素5 10-5苏氨酸脱氨酶苏氨酸脱氨酶苏氨酸苏氨酸5 10-3丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶丙酮酸丙酮酸4 10-4HCO3-1 10-3ATP6

33、 10-53-2-4-1 底物浓度对反应速率的影响（底物浓度对反应速率的影响（5）vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。vmax的意义：的意义：如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从vmax计算酶的转换数计算酶的转换数TN（turnover number），即动力学常数），即动力学常数k3酶的转换数酶的转换数TN：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数，可用来比较每单位酶的酶分子

34、催化底物转变为产物的分子数，可用来比较每单位酶的催化能力。催化能力。EVTNmax km与与vmax的测定（的测定（1）双倒数作图法（双倒数作图法（Linweaver-Burk作图法）作图法）maxmaxmmaxmmmaxv1S1vkv1SvSkv1SkSvv 纵轴截距为：纵轴截距为：max1V斜率为：斜率为：maxVKm横轴截距为：横轴截距为：mK1km与与vmax的测定（的测定（2）Hanes作图法作图法 maxmmaxmaxmaxmmaxmaxmvkSv1vSSv1SS1vkSv1v1S1vkv1 纵轴截距为：纵轴截距为：maxmVk斜率为：斜率为：maxV1横轴截距为：横轴截距为：mk

35、 maxv/13-2-4-2 酶浓度对反应速率的影响酶浓度对反应速率的影响当当SE，即酶可被底物饱和的情况下，反应速，即酶可被底物饱和的情况下，反应速率与酶浓度成正比。率与酶浓度成正比。Ekv3 3-2-4-3 温度对反应速率的影响温度对反应速率的影响双重影响双重影响 温度升高，酶促反应速率升高；但又会引起酶变性，导致温度升高，酶促反应速率升高；但又会引起酶变性，导致反应速率降低。反应速率降低。低温保存低温保存注明反应温度注明反应温度最适反应温度与反应时间有关最适反应温度与反应时间有关optt温度温度温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响3-2-4-4 pH对反应速率的影响对反应速率的影

36、响pH酶酶活活力力影响酶蛋白构象影响酶蛋白构象影响底物、酶等影响底物、酶等的解离状态的解离状态影响到酶专一性影响到酶专一性和活性中心构象相和活性中心构象相关基团的解离关基团的解离酶在试管反应中的最适酶在试管反应中的最适pH与其所在正常细胞的生理与其所在正常细胞的生理pH不一定完全相同不一定完全相同3-2-4-5 抑制剂对反应速率的影响（抑制剂对反应速率的影响（1）酶的抑制剂（酶的抑制剂（inhibitor）凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质与酶变性的区别与酶变性的区别 抑制剂对酶有一定的选择性抑制剂对酶有一定的选择性 引起变性的因素对酶

37、没有选择性引起变性的因素对酶没有选择性抑制作用的类型抑制作用的类型 不可逆性抑制不可逆性抑制 可逆性抑制：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制可逆性抑制：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制3-2-4-5 抑制剂对反应速率的影响（抑制剂对反应速率的影响（2）不可逆抑制不可逆抑制 抑制剂通常以抑制剂通常以共价键共价键与酶活性中心的必须基团结合，使酶失活。与酶活性中心的必须基团结合，使酶失活。例如：例如：有机磷化物有机磷化物羟基酶；解毒羟基酶；解毒解磷定（解磷定（PAM）重金属离子及砷化合物重金属离子及砷化合物巯基酶；解毒巯基酶；解毒二巯基丙醇二巯基丙醇3-2-4-5 抑制剂对反应速率的影响（

38、抑制剂对反应速率的影响（3）可逆性抑制作用可逆性抑制作用 抑制剂通常以抑制剂通常以非共价键非共价键与酶或酶与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去类型类型竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制竞争性抑制（竞争性抑制（1）定义：定义：抑制剂与底物的抑制剂与底物的结构相似结构相似，能与底物竞争酶的活性中，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶心，从而阻碍酶-底物复合物的形成，使酶的活性降低。底物复合物的形成，使酶的活性降低。反应模式：反应模式：PEESS

39、E IEIESESEPEIEI特点：特点：I与与S结构类似，竞争酶的活性中心结构类似，竞争酶的活性中心抑制程度取决于抑制剂与酶相对亲和力及底物浓度抑制程度取决于抑制剂与酶相对亲和力及底物浓度动力学特点：动力学特点：vmax不变，表观不变，表观km增大增大 SkI1kSvvimmax maximaxmv1S1kI1vkv1 竞争性抑制（竞争性抑制（2）琥珀酸琥珀酸延胡索酸延胡索酸FAD2FADH琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶二氢碟呤啶二氢碟呤啶+对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸+谷氨酸谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸合成酶磺胺类药物磺胺类药物二氢叶酸二氢叶酸磺胺类药物的抑菌机理磺胺类药物的抑菌机理细菌通过此途径获

40、得核苷酸细菌通过此途径获得核苷酸合成中重要的辅酶：四氢叶酸合成中重要的辅酶：四氢叶酸PEESSE IEIS EIS非竞争性抑制非竞争性抑制反应模式：反应模式：I特点：特点：抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系抑制程度取决于抑制剂的浓度抑制程度取决于抑制剂的浓度动力学特点：动力学特点：vmax降低，表观降低，表观km不变不变 imaximaxmkI1v1S1kI1vkv1反竞争性抑制反竞争性抑制反应模式：反应模式：PE ES SE IEIS特点：特点：抑制剂只与酶抑制剂只与酶-底物复合物结合底物复合物结合 抑

41、制程度取决于抑制剂的浓度及底物浓度抑制程度取决于抑制剂的浓度及底物浓度 动力学特点：动力学特点：vmax降低，表观降低，表观km降低降低 imaxmaxmkI1v1S1vkv13-2-4-5 抑制剂对反应速率的影响（抑制剂对反应速率的影响（4）作用特征作用特征无抑制剂无抑制剂竞争抑制竞争抑制非竞争抑制非竞争抑制反竞争抑制反竞争抑制与与I结合部分结合部分EE、ESES动力学参数动力学参数表观表观KmKm增大增大不变不变减小减小vmax不变不变不变不变降低降低降低降低林林-贝氏贝氏作图作图斜率斜率Km/vmax增大增大增大增大不变不变纵轴截距纵轴截距1/vmax不变不变增大增大增大增大横轴截距横轴

42、截距-1/km增大增大不变不变减小减小各种可逆性抑制作用的比较各种可逆性抑制作用的比较3-2-4-6 激活剂对反应速率的影响激活剂对反应速率的影响激活剂（激活剂（activator）是指是指使酶由无活性酶前体（酶原）变为有活性或使酶活性增加的物使酶由无活性酶前体（酶原）变为有活性或使酶活性增加的物质。大部分是离子或简单的有机化合物，它们可能在酶与底物结合质。大部分是离子或简单的有机化合物，它们可能在酶与底物结合时起桥梁作用，如时起桥梁作用，如Mg2+能激活磷酸酯酶，能激活磷酸酯酶，Cl-能激活能激活-淀粉酶等。淀粉酶等。按分子大小可分为：按分子大小可分为：无机离子如无机离子如K+、Mg2+、C

43、a2+、Br-、Cl-、H+等；等；有机分子如谷胱甘肽、有机分子如谷胱甘肽、EDTA等；等；蛋白质等生物大分子。蛋白质等生物大分子。按其必需性可分为：按其必需性可分为：必需激活剂和非必需激活剂必需激活剂和非必需激活剂3-3 酶法分析检测技术酶法分析检测技术酶法分析的对象可以是酶、底物或其类似物、活化剂或抑制酶法分析的对象可以是酶、底物或其类似物、活化剂或抑制剂等。剂等。凡可影响酶催化反应的各种物质都有可能被分析凡可影响酶催化反应的各种物质都有可能被分析。根据被分析对象影响的是反应速率还是反应平衡，酶法分析根据被分析对象影响的是反应速率还是反应平衡，酶法分析可分为可分为动力学方法动力学方法（即反

44、应速率法，如固定时间（即反应速率法，如固定时间/变化分析法变化分析法和连续监测法）和和连续监测法）和平衡法平衡法。酶活性、活化剂和抑制剂的测定只能采用动力学方法酶活性、活化剂和抑制剂的测定只能采用动力学方法；底物；底物及其类似物的测定则动力学方法和平衡法均可。及其类似物的测定则动力学方法和平衡法均可。3-3-1 酶法分析的检测手段（酶法分析的检测手段（1）光学分析法（光学分析法（1）UV-Vis分光光度法：分光光度法：利用底物和产物在利用底物和产物在UV-Vis区的吸收差异实现测定。区的吸收差异实现测定。该法该法灵敏，简便，应用广，除氧化还原酶外，许多激酶（转移酶）、酯酶、灵敏，简便，应用广，

45、除氧化还原酶外，许多激酶（转移酶）、酯酶、肽酶等都广泛采用该方法。肽酶等都广泛采用该方法。例例1：脱氢酶的辅酶脱氢酶的辅酶NADH/NADPH在在340 nm有吸收，其氧化型有吸收，其氧化型NAD+/NADP+在在300400 nm处无吸收；处无吸收；例例2：细胞色素细胞色素c（细胞色素氧化酶的底物）的还原型和氧化型在（细胞色素氧化酶的底物）的还原型和氧化型在510 nm处处的的 分别为分别为2.8 104和和8.0 103，利用该差异也可实现测定；，利用该差异也可实现测定；例例3：过氧化物酶可催化过氧化物酶可催化H2O2氧化多种人工底物发生显色反应。氧化多种人工底物发生显色反应。OCH3OH

46、4OOOOO C H3O C H3O C H3O C H3Peroxidase22OHnm 470max 3-3-1 酶法分析的检测手段（酶法分析的检测手段（2）光学分析法（光学分析法（2）荧光法：荧光法：利用底物或产物的荧光强度实现测定。该法灵敏度利用底物或产物的荧光强度实现测定。该法灵敏度光度法光度法24个数量级），适合低含量的酶或底物的分析。个数量级），适合低含量的酶或底物的分析。例例1：脱氢酶等的底物本身在反应过程就有荧光变化：脱氢酶等的底物本身在反应过程就有荧光变化：NADH/NADPH在中在中性溶液中可产生蓝色荧光（性溶液中可产生蓝色荧光（ex=340 nm；em=460 nm）例

47、例2：可可利用荧光源底物的反应，如酯化荧光素测定脂肪酶：酯化荧光素无利用荧光源底物的反应，如酯化荧光素测定脂肪酶：酯化荧光素无荧光或仅发弱荧光，但水解后释放荧光素。荧光或仅发弱荧光，但水解后释放荧光素。例例3：过氧化物酶可催化过氧化物酶可催化H2O2氧化多种人工底物发生荧光反应氧化多种人工底物发生荧光反应2COOHOHOCH3COOHOHOCH3OHH3COHOOCnm450nm335emex Peroxidase22OH3-3-1 酶法分析的检测手段（酶法分析的检测手段（3）光学分析法（光学分析法（3）化学发光法：化学发光法：利用酶催化反应激发物质所产生的光强度实现测定。该法利用酶催化反应激

48、发物质所产生的光强度实现测定。该法灵敏度灵敏度荧光法，适合低含量的酶或底物的分析。荧光法，适合低含量的酶或底物的分析。例例1：鲁米诺发光体系：测定鲁米诺发光体系：测定H2O2、葡萄糖、尿酸、胆固醇等、葡萄糖、尿酸、胆固醇等例例2：虫荧光素发光体系：测定虫荧光素发光体系：测定ATP及及ATP参与或产生参与或产生ATP的反应体系的反应体系例例3：细菌荧光素发光体系：测定黄素核苷酸、细菌荧光素发光体系：测定黄素核苷酸、NADH和和NADPH nm 425-3 OH 22发光发光氨基邻苯二甲酸氨基邻苯二甲酸鲁米诺鲁米诺催化剂催化剂 nm 562 ADP O ATP 2发光发光氧虫荧光素氧虫荧光素虫荧光

49、素虫荧光素虫荧光素酶虫荧光素酶 nm 490450 OHRCOOH O 22发发光光黄黄素素核核苷苷酸酸长长链链醛醛还还原原态态黄黄素素核核苷苷酸酸细细菌菌荧荧光光素素酶酶 3-3-1 酶法分析的检测手段（酶法分析的检测手段（4）电化学测定法（电化学测定法（1）灵敏度和准确度都很高，可和光学方法相比；测定系统中有某些物灵敏度和准确度都很高，可和光学方法相比；测定系统中有某些物质污染，不会影响结果。质污染，不会影响结果。电位法（离子选择性电极）电位法（离子选择性电极）例如：例如：pH电极可用于产酸反应的测定。电极可用于产酸反应的测定。随着反应的进行，溶液随着反应的进行，溶液pH改变会引起酶活力变

50、化；待测样品中往往包含改变会引起酶活力变化；待测样品中往往包含大量具有强缓冲能力的惰性蛋白，使测定结果不易准确。可采用恒酸滴定大量具有强缓冲能力的惰性蛋白，使测定结果不易准确。可采用恒酸滴定法克服。法克服。恒酸滴定法：恒酸滴定法：在反应过程中，不断向反应系统加酸或碱使在反应过程中，不断向反应系统加酸或碱使pH维持恒定，维持恒定，以加酸或碱的速度代表反应速度。（恒酸滴定仪）以加酸或碱的速度代表反应速度。（恒酸滴定仪）3-3-1 酶法分析的检测手段（酶法分析的检测手段（4）电化学测定法（电化学测定法（2）伏安法：伏安法：在浸入溶液中的两电极上施加一定电压，使待测物质在电极上在浸入溶液中的两电极上施

51、加一定电压，使待测物质在电极上发生氧化还原反应并产生电解电流，根据电流大小可测定其浓度。各种物发生氧化还原反应并产生电解电流，根据电流大小可测定其浓度。各种物质产生电极反应所需要的电极电压不同，可进行选择性测定。质产生电极反应所需要的电极电压不同，可进行选择性测定。例例1：电流测定法（电流测定法（Pt电极间电极间Fe2+氧化还原电流变化与酶反应速率呈正比）氧化还原电流变化与酶反应速率呈正比）例例2：溶解氧能在较低的负电压（溶解氧能在较低的负电压（0.65V左右）条件下还原，而能在这种电左右）条件下还原，而能在这种电极电压水平下发生反应的物质很少，因此可用来测定氧化还原反应，如葡极电压水平下发生

52、反应的物质很少，因此可用来测定氧化还原反应，如葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶等。（溶解氧电极）萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶等。（溶解氧电极）溶解氧电极溶解氧电极222OH O 葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸葡萄糖葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶OH Fe OH Fe23222 3-3-1 酶法分析的检测手段（酶法分析的检测手段（5）放射化学测定法放射化学测定法原理：原理：底物用同位素标记。随着酶催化反应进行，将定量生成标记的产底物用同位素标记。随着酶催化反应进行，将定量生成标记的产物。一定时间后停止反应，将产物和底物分离，测定产物或未反应底物的物。一定时间后停止反应，将产物和底物分离，测定产物或未反应底物的放射性

53、，即可推算出底物转化量。放射性，即可推算出底物转化量。该法灵敏度极高，且已知的六大类酶几乎都可用此法测定。通常用于底该法灵敏度极高，且已知的六大类酶几乎都可用此法测定。通常用于底物标记的同位素有物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和和131I，它们在衰变过程中放射的都是，它们在衰变过程中放射的都是 粒子。但该法操作较繁费时，无法进行连续跟踪且同位素的保存和操作必粒子。但该法操作较繁费时，无法进行连续跟踪且同位素的保存和操作必须特别小心（尽量避免使用）。有些酶反应目前还只能采用此法测定。须特别小心（尽量避免使用）。有些酶反应目前还只能采用此法测定。314CH 33222CHNCHCHCO

54、 胆碱酯酶胆碱酯酶314CHHCO2 3322CHNCHHOCH 3-3-1 酶法分析的检测手段（酶法分析的检测手段（6）量气法：量气法：底物或者产物为气体时，可通过测量反应体系中气相体底物或者产物为气体时，可通过测量反应体系中气相体积或压力的改变，计算出气体释放或吸收的量，进一步求得酶反应积或压力的改变，计算出气体释放或吸收的量，进一步求得酶反应速率。最常用的气体测量仪器为速率。最常用的气体测量仪器为瓦氏呼吸仪瓦氏呼吸仪，该法可以连续获取数，该法可以连续获取数据，但灵敏度低。据，但灵敏度低。量热法：量热法：采用高灵敏采用高灵敏量热计量热计测定酶催化反应中的热量变化测定酶催化反应中的热量变化。

55、例：例：pH8的的Tris缓冲液中用己糖激酶测定血清中的葡萄糖缓冲液中用己糖激酶测定血清中的葡萄糖 HADP6ATP磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖葡葡萄萄糖糖己己糖糖激激酶酶1molKJ28H HTrisHTris1molKJ47H 3-3-2 酶法分析中测定方法酶法分析中测定方法酶促反应过程可大致分为二个时期：开始为酶促反应过程可大致分为二个时期：开始为动态期动态期，酶促反应按，酶促反应按一定速率进行，反应物浓度随时间变化且变化逐渐减小；到一定时一定速率进行，反应物浓度随时间变化且变化逐渐减小；到一定时间后酶促反应到达平衡或终点（间后酶促反应到达平衡或终点（平衡期平衡期），此时反应速率为零，反），此时

56、反应速率为零，反应物浓度不变。应物浓度不变。根据所测反应是到达平衡前或后，酶法分析可分为根据所测反应是到达平衡前或后，酶法分析可分为动态法动态法/速率法速率法/或或平衡法平衡法/终点法终点法。Time动态期动态期平衡期平衡期3-3-2-1 终点法终点法终点法终点法（end-point method）：又称总变化量法。先借助酶）：又称总变化量法。先借助酶促反应（单酶或几种酶偶联）使促反应（单酶或几种酶偶联）使被测物质定量转化被测物质定量转化，然后测定，然后测定底物、产物或辅酶物质（第二产物）等的变化量。根据所用酶底物、产物或辅酶物质（第二产物）等的变化量。根据所用酶促反应的体系不同可分为：促反应

57、的体系不同可分为：单酶定量法单酶定量法酶促偶联定量法酶促偶联定量法终点法测定的是底物的终点法测定的是底物的总变化量总变化量，即浓度。该法，即浓度。该法只能用于底只能用于底物测定物测定，而不能用于酶活性、活化剂和抑制剂的测定，而不能用于酶活性、活化剂和抑制剂的测定。单酶定量法（单酶定量法（1）单酶反应只需一种催化酶：单酶反应只需一种催化酶：。定量时可测定底物的减少。定量时可测定底物的减少量或产物增加量，对含辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有效的量或产物增加量，对含辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有效的方法。（根据实际情况确定）方法。（根据实际情况确定）测定产物增加量测定产物增加量脱氢酶法测定乳酸：脱

58、氢酶法测定乳酸：脱氢酶法测定脱氢酶法测定-羟丁酸羟丁酸草酸脱羧酶测定草酸：草酸脱羧酶测定草酸：PSE H NADH HOOCCOCH NAD CHOHHOOCCH33乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶nm 340max H NADH NAD-乙酰乙酸乙酰乙酸羟丁酸羟丁酸羟丁酸脱氢酶羟丁酸脱氢酶nm 340max 2CO 甲酸甲酸草酸草酸草酸脱羧酶草酸脱羧酶瓦瓦式式呼呼吸吸仪仪单酶定量法（单酶定量法（2）测定底物减少量测定底物减少量紫外法测定尿酸：紫外法测定尿酸：尿酸在尿酸在293 nm处有吸收，而其产物尿囊素没有，处有吸收，而其产物尿囊素没有，根据根据293 nm处吸光度的下降即可得尿酸含量。处吸光度的下降

59、即可得尿酸含量。胆红素的测定：胆红素的测定：胆红素在胆红素在450 nm处有吸收，而其产物胆绿素没有，处有吸收，而其产物胆绿素没有，根据根据450 nm处吸光度的下降即可得胆红素含量。处吸光度的下降即可得胆红素含量。血氨的测定：血氨的测定：在谷氨酸脱氢酶的作用下，血浆中的在谷氨酸脱氢酶的作用下，血浆中的NH4+与与-酮戊酮戊二酸和二酸和NADPH（max=340 nm）反应，生成谷氨酸和）反应，生成谷氨酸和NADP+。OH O 22 胆绿素胆绿素胆红素胆红素胆红素氧化酶胆红素氧化酶22222OH CO OH O 尿囊素尿囊素尿酸尿酸尿酸氧化酶尿酸氧化酶酶促偶联定量法（酶促偶联定量法（1）酶促偶

60、联定量法：酶促偶联定量法：若酶促反应的底物或产物没有能被直接检若酶促反应的底物或产物没有能被直接检测的成分，可将反应的某一产物偶联到另一个酶促反应中，从测的成分，可将反应的某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而实现检测目的。而实现检测目的。最常用的指示酶有最常用的指示酶有脱氢酶脱氢酶（产物有（产物有NADH/NADPH或或NAD+/NADP+或能与之反应）和或能与之反应）和过氧化物酶过氧化物酶（产物有（产物有过氧化物或能过氧化物或能与之反应）。与之反应）。2E1EPPS21指示酶指示酶待测物酶待测物酶nm 505max 酶促偶联定量法（酶促偶联定量法（2）脱氢酶指示体系脱氢酶指示体系血清葡萄糖己

61、糖激酶法测定血清葡萄糖己糖激酶法测定血清尿素的测定血清尿素的测定血浆中碳酸氢根的测定血浆中碳酸氢根的测定 H NADPH GA-6-P NADP ADP P-6-G ATP GluPD-6-GHK NAD OH NADH -CO 2NH OH 2GLDH232谷氨酸谷氨酸酮戊二酸酮戊二酸尿素尿素尿素酶尿素酶酶促偶联定量法（酶促偶联定量法（3）过氧化物酶指示体系过氧化物酶指示体系血清葡萄糖过氧化物酶法测定血清葡萄糖过氧化物酶法测定血清总胆固醇的测定血清总胆固醇的测定血清甘油三脂的测定血清甘油三脂的测定OH -4 OH O 2POD22GOD2 醌亚胺类化合物醌亚胺类化合物酚酚氨基安替比林氨基安替

62、比林葡萄糖酸葡萄糖酸葡萄糖葡萄糖OH -4 OH O OH 2POD422COD2CEH2 醌亚胺类化合物醌亚胺类化合物酚酚氨基安替比林氨基安替比林胆甾烯酮胆甾烯酮胆固醇胆固醇游离脂肪酸游离脂肪酸游离胆固醇游离胆固醇胆固醇酯胆固醇酯OH -4 -OH O -3 ADP-3 ATP OH 2POD2222 醌亚胺类化合物醌亚胺类化合物酚酚氨基安替比林氨基安替比林羟丙酮羟丙酮磷酸磷酸磷酸甘油磷酸甘油磷酸甘油磷酸甘油甘油甘油脂肪酸脂肪酸甘油甘油甘油三酯甘油三酯磷酸甘油氧化酶磷酸甘油氧化酶甘油激酶甘油激酶脂肪酶脂肪酶3-3-2-2 速率法（速率法（1）速率法速率法（rate assay）：又称动力学法

63、、连续检测法，测定的）：又称动力学法、连续检测法，测定的是酶促反应的初速率（即反应初期底物消耗量较少，通常是酶促反应的初速率（即反应初期底物消耗量较少，通常5%时的反应速率）。时的反应速率）。定量依据：定量依据：当酶促反应呈一级反应时，反应当酶促反应呈一级反应时，反应速率速率v与待测物浓度成正比。初速率的测定方法有：与待测物浓度成正比。初速率的测定方法有：固定时间固定时间（变化）（变化）法法连续测定法连续测定法速率法的关键是如何使酶促反应成为一级反应。速率法的关键是如何使酶促反应成为一级反应。SkvvSkSvvmmaxkSmmaxm 3-3-2-2 速率法（速率法（2）固定时间法：固定时间法：

64、测定反应开始后测定反应开始后一段时间内一段时间内产物的增加或底物产物的增加或底物的减少量。该方法需在反应进的减少量。该方法需在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。蛋白沉淀剂等终止反应。该法简单方便，但不预做实该法简单方便，但不预做实验无法了解反应时间段是否处验无法了解反应时间段是否处于线性区，较难保证测定结果于线性区，较难保证测定结果的准确性。的准确性。与之类似的有与之类似的有固定变化法固定变化法。连续测定法：连续测定法：在多个时间点连在多个时间点连续测定产物或底物在线性期内的续测定产物或底物在线性期内的生成或消耗量。有些仪器可自动生成或消耗量。

65、有些仪器可自动完成该检测过程（时间扫描）。完成该检测过程（时间扫描）。该法可明显找到反应线性区，该法可明显找到反应线性区，结果较为准确可靠，但要求底物结果较为准确可靠，但要求底物或产物能够直接测量。或产物能够直接测量。终点法与速率法的比较终点法与速率法的比较区别区别速率法速率法终点法终点法检测速度检测速度较快较快较慢较慢检测成本检测成本酶用量少，成本低酶用量少，成本低酶用量大，成本高酶用量大，成本高样品背景信号样品背景信号影响小影响小影响大影响大操作难度操作难度略高略高较低较低准确度准确度一般一般较好较好酶活性下降对终点法影响较小，仅使其达到平衡所需时间延长，酶活性下降对终点法影响较小，仅使其

66、达到平衡所需时间延长，检测范围变窄；但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚检测范围变窄；但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。因此代谢物酶法分析大多选择终点法。至一级反应丧失。因此代谢物酶法分析大多选择终点法。3-3-2-3 酶循环法（酶循环法（1）酶循环法酶循环法（enzymatic cycling assay）：利用底物和辅酶的反复反）：利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数。应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数。反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，可反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，可达到高灵敏度和特异性的要求达到高灵敏度和特异性的要求根据试剂酶的结合方式和辅酶的用法，可将酶循环法分为根据试剂酶的结合方式和辅酶的用法，可将酶循环法分为底物循底物循环法环法和和辅酶循环法辅酶循环法。根据反应方式的不同又可分为氧化酶脱氢酶反。根据反应方式的不同又可分为氧化酶脱氢酶反应法和脱氢酶辅酶反应法等。应法和脱氢酶辅酶反应法等。该法灵敏度取决于循环反应的速率和次数。循环反应