植物基因表达的启课件

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1、植物基因表达的启1 一、启动子的结构一、启动子的结构启动子：启动子：位于结构基因位于结构基因5端上游、能够指导端上游、能够指导RNA聚合聚合酶同模板正确结合、启动基因转录的一段酶同模板正确结合、启动基因转录的一段DNADNA序列序列。启动子区启动子区增强子区增强子区结构基因结构基因植物基因表达的启2 真核启动子比原核更复杂、序列也更长，它不像原核启动子那样有明显共同一致的序列，而且单靠RNA聚合酶难以起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用。不同真核启动子之间大小、序列很不相同。不同物种的启动子有时不能互用，如动物和植物之间。真核启动子中包含了许多调节基因转录的元件，它们控制着基因表达的

2、强弱或者时空差异。根据对基因表达的必须性，这些元件分为2类：核心启动子元件和上游启动子元件植物基因表达的启3 （1）TATA框(TATA box)：位于5端转录起始点上游约20-30个核苷酸的地方。TATA框是一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为TATAATAA。TATA框是RNA聚合酶的重要的接触点，它能够使酶准确地识别转录的起始点并开始转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA的转录就会从不正常的位置开始。（2）CAAT框(CAAT box)：位于5端转录起始点上游约70-80个核苷酸的地方。CAAT框是启动子中另一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为GGCTCAATCT。CAAT框是RNA

3、聚合酶的另一个结合点，一般认为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当这段顺序被改变后，mRNA的形成量会明显减少。1.核心启动子元件核心启动子元件(core promoter element):指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括TATA盒和 CAAT盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。植物基因表达的启4 11281 tttcccgcct tcagtttagc ttcatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac 11341 tcgccgtaaa gactggcgaa cagttcatac agagtct

4、ctt acgactcaat gacaagaaga 11401 aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata 11461 cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc 11521 tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag 11581 gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttg

5、aa gatgcctctg 11641 ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 11701 ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 11761 acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 11821 tggagagaac acgggggact cttgac花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒35S启动子启动子=CaMV35S启动子启动

6、子TATA框(TATA box)CAAT框(CAAT box)植物基因表达的启5 2.上游启动子元件上游启动子元件(upstream promoter element):包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的时间与空间表达调控。这些上游启动子元件中，最普遍的是增强子元件。植物基因表达的启6 3.增强子（增强子（enhancer）是一种能够提高同一条DNA链上基因转录效率的顺式调控元件。最早是在SV40病毒中发现的长约200b

7、p的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物和原核生物中都发现了增强子。增强子通常长100200bp，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为812bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：植物基因表达的启7v增强子可以远距离作用。通常可距离1-4 kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。v增强子作用与其序列的正反方向无关。将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。植物基因表达的启8v增强子要有启动子才能发挥作用。没有启动子存在，增强子单独不能表现活性。

8、v增强子对启动子没有严格的专一性。同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。例如当含有增强子的病毒基因组整合入宿主细胞基因组时，能够增强整合区附近宿主某些基因的转录；当增强子随某些染色体段落移位时，也能提高移到的新位置周围基因的转录。植物基因表达的启9植物基因表达的启101pCambia-Agl5-iaaM16500bpLBpolyAHygromycin2X CaMV35SKanamycinnos iaaMAgl5lacZ35S PGUSplusnosRBEcoRI(1)XhoI(15500)XhoI(14500)SacI(300)SalI(1430)NcoI(2400)SalI(4500)Ps

9、tISphIHindIII(4520)NcoI(5200)BglII(5206)NheI(7250)NheI(10650)带增强子的带增强子的35S启动子启动子植物基因表达的启114.静止子(silencer)最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多，但从已有的例子看到：静止子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。植物基因表达的启121.组成型启动子组成型启动子 可以在所有细胞、组织和器官中持续发挥作用的启动子。如看家基因的启动子。组成型启动子用来控

10、制基因的持续表达，如抗病、抗虫、抗不良环境的基因。在植物基因工程中，用于控制基因组成型表达的启动子主要有2个来源：微生物和植物。二、二、启动子的类型启动子的类型植物基因表达的启131.1病毒来源的组成型启动子病毒来源的组成型启动子CaMV35S 启动子启动子 CaMV 35S 启动子是花椰菜花叶病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV)双链DNA病毒基因组中启动35S RNA基因转录的启动子，CaMV 35S promoter，它可以利用宿主细胞核 RNA 聚合酶进行基因转录，并且不依赖于病毒的产物。植物基因表达的启1435S35S启动子的结构启动子的结构+9-90-3

11、43Domain A Domain B Domain A:与在根部起作用有关。Domain B：是烟草转录因子ASF-1的结合部位，与在植物叶片、茎等绿色组织中起作用有关。上游部分：上游部分：与转录强度有关（增强子功能）。与转录强度有关（增强子功能）。含有重复的含有重复的-343-90部分的部分的35S启动子比启动子比350bp的的35S启动子的强度大启动子的强度大10倍。倍。35S启动子的核心长度为60bp左右；其上游有其它元件，控制启动子的转录效率和特异性，其中包括增强子。增强子增强子植物基因表达的启15 CaMV 35S 启动子是一个组成型启动子，不仅可以能在双子叶植物中高效启动基因表达

12、，而且在许多单子叶植物中也可以高效启动基因表达。另外 CaMV 35S 启动子内部没有我们常用的酶切位点，因而容易克隆和使用，在植物基因工程中得到了广泛的应用。35S 启动子控制的GUS基因在烟草中表达茎叶片横切面根花幼苗植物基因表达的启16 由于CaMV 35S 启动子在植物中成功的应用，人们也克隆了其它病毒的启动子，如cassava（木薯）vein mosaic virus(CsVMV)promoter，Australian banana streak virus(BSV)promoters，mirabilis mosaic virus(MMV)promoter and figwort（玄

13、参）mosaic virus(FMV)promoter，这些启动子也能够在植物中高效高效启动基因的转录。植物基因表达的启17 利用病毒来源的启动子进行植物转基因有令人担心的问题，如：转基因食物与感染人类的病毒存在时，启动子可能与病毒基因重组、导致病毒基因的大量表达。植物细胞可能不识别病毒来源的启动子序列，把它当作外源DNA，对它进行修饰、使它失去作用，导致基因沉默。植物基因表达的启18原核生物组成型启动子之二：原核生物组成型启动子之二：农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子 Nos promoterNos promoter35S promoterNos promoter烟草卫

14、矛植物基因表达的启191.2 植物来源的组成型启动子植物来源的组成型启动子 在植物中有很多看家基因，在各种类型细胞和所有时间内都表达。启动这些基因表达的启动子就是组成型启动子。现在许多这类启动子已经被克隆，并在植物基因工程得到了应用。肌动蛋白（肌动蛋白（actin）是细胞基本骨架的成分，actin基因家族的基因都是组成型基因，其启动子就是组成型启动子。通过检测报告基因的表达，发现1.5kb的拟南芥actin2基因启动子几乎在拟南芥所有器官和整个发育过程中都起作用，仅在种皮、胚轴、子房和花粉囊中不起明显作用。水稻的actin1基因启动子仅不在木质部中起作用。植物基因表达的启20拟南芥拟南芥ACT

15、IN2基因启动子分析基因启动子分析植物基因表达的启21植物基因表达的启22 Ubiquitin（泛素蛋白）（泛素蛋白）也是细胞中重要的基本成分，参与了许多重要生命过程，如蛋白质转运、染色质结构、DNA修复等。来自玉米的Ubiquitin1基因的启动子（pUbi）是用得比较多的植物启动子之一，特别是在单子叶植物中，在玉米中pUbi的作用是35S启动子的10倍。来自烟草的Ubi.U4基因的启动子(-263bp)在烟草中的作用比35S启动子好。植物基因表达的启232.特异启动子特异启动子 在基因工程中利用组成型启动子高表达基因常常带来许多麻烦，如影响植物的正常生长发育，转基因植物安全性等问题，所以我

16、们希望在时空上能够控制基因的表达，因此就要用细胞、组织、器官特异启动子。转转35S-Kn1-Nos基因的烟草基因的烟草转转35S-Kn1-Nos基因的地黄基因的地黄植物基因表达的启242.1组织特异启动子（tissue-specific promoter）就是只在特定的组织或者器官（根、叶片、子房、花粉、花原基、种皮等）中起作用的启动子。植物维管组织特异启动子植物维管组织特异启动子植物基因表达的启25 2.2果实特异性启动子 果实是食用器官，利用果实特异性启动子可以改良果实品质、生产疫苗。苹果和番茄果实中1-aminocyclopropane-1-carboxylate(1-氨基环丙烷氨基环丙

17、烷-1-羧酸羧酸，ACC)oxidase gene（E8 gene）和polygalacturonase(多聚半乳糖醛酸酶，PG)genes 启动子在果实成熟是起作用。番茄PG启动子用来提高番茄果实中胡萝卜素的含量；番茄E8启动子表达virus-F protein，生产疫苗，提高了老鼠系统免疫能力。植物基因表达的启262.3种子种子/籽粒特异启动子籽粒特异启动子 种子/籽粒是很多植物的收获器官，具有重要经济价值，其质量和品质一直受到人们的关注，如食品中蛋白质、油脂、维生素的含量提高、棉花纤维长度的提高、有用物质（蛋白、酶、疫苗的生产等）都可以通过种子/籽粒特异启动子启动有关基因的表达而实现。这

18、类启动子有：soybean-conglycinin基因启动子在胚成熟的中、后期起作用；sunflower helianthinin基因启动子在发育的种子中起作用；French bean phaseolin基因启动子只在发育的种子的胚乳和胚起作用；cotton a-globulin 基因启动子可以在棉花、烟草、拟南芥发育的种子中起作用。种皮特异启动子：A pea -1,3-glucanase 基因（PsGNS2）只在种皮中起作用。植物基因表达的启272.4块根/块茎储藏器官特异启动子 B33 and PAT 21是土豆的糖蛋白的主要成员，分析表明B33 and PAT 21基因的表达最主要是在块

19、茎形成的过程中，表明B33 and PAT 21基因的启动子是块茎特异性的。Sporamin（红薯特殊贮藏蛋白）and-淀粉酶是红薯块根中2个主要的可溶性蛋白，研究表明Sporamin 几乎都在块根中表达（1%4.5%在茎中)。植物基因表达的启282.5 花花/花序特异启动子花序特异启动子 花是重要的观赏器官，花色、花形、花的寿命和香气等是花卉重要性状。1.45 kb的菊花内源ubiquitin extension protein 基因启动子(UEP1)在花中的作用是在叶片中作用的9倍，比 CaMV 35S启动子在菊花中的作用高 4085倍。控制拟南芥花瓣中蜡质合成的基因（CER6）启动子也可

20、以在菊花花瓣中特异起作用。拟南芥leafy,ap1,ap3，PI 等花器官发育基因的启动子植物基因表达的启29Pleafy-barnase-Tnos无花植物表达载体无花植物表达载体植物基因表达的启302.6 花粉花粉/花药特异启动子花药特异启动子 烟草花粉特异启动子 TA29,番茄花粉特异启动子 lat52，水稻花粉特异 RA8 gene启动子、玉米ZmC5基因启动子、ZM13启动子都是花粉特异启动子.花粉特异启动子被广泛用来创造核雄性不育植物。花粉特异启动子barnase(RNase)载体已经用来转烟草、油菜、水稻、玉米等；花粉特异启动子还可以进行基因删除，防止外源基因通过花粉污染其它非转基

21、因（作物）植物，提高转基因作物的生物安全性。植物基因表达的启312.7根特异启动子根特异启动子 Agrobacterium rhizogenes rolD 基因启动子（373-426bp）、90bp的35S启动子具有根特异性；烟草的TobRB7启动子、Arabidopsis thaliana pyk10启动子、松树PmPR10-1.14启动子。植物基因表达的启32(A)2-day-old seedling;(B)3-day-old seedling showing GUS-staining throughout the whole plant,with exception of the elo

22、ngation zone of the root;(C)5-day-old seedling with a reduction of gus-activity in cotyledons;(D)7-day-old seedling showing that the hypocotyl is no more stained;(E)10-day-old seedling with no GUS-staining in the upper parts of the plant;(F)14-day-old seedling;(G)stained roots showing gus-activity a

23、long the whole main root;(H)transition zone between hypocotyle and root.(IT)Gus-activity under control of the promoter construct C,(I)2-day-old seedling;(K)3-day-oldseedling;(L)5-day-old seedling;(M)7-day-old seedling without GUS-staining in the hypocotyl;植物基因表达的启33(N)10-day-old seedling showing GUS

24、-staining in cotyledons,in the midrib region and marginal parts of the leaves and in hydathodes;(O)14-day-old seedling with a strong reduction of gus-activity in the upper part of the plant;(P)stained roots showing a strong gus-activity along the whole main root;(Q)close-up of stained roots showing

25、gus-activity preponderantly in the central region of the root or in the whole root;(R)close-up of a stained root showing gus-activity in the outer parts of the root;(S)close-up of stained root tips and root hairs;(T)lateral roots with GUS-staining only in the root tip;(UW)stained cross sections of m

26、ain roots;(X)stained cross section near the root tip;(Y)close-up of a pod abscission site.植物基因表达的启34 根特异启动子在提高植物利用肥料、适应土壤环境、提高对土壤病害抗性等基因过程方面具有重要作用植物基因表达的启352.8 叶片叶片/绿色组织特异启动子绿色组织特异启动子 属于光诱导型启动子 研究最清楚的是编码 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶）小亚基的 rbcS multigene family的启动子。另外，chlorophyl

27、l a/b-binding(Cab)protein genes的启动子.。植物基因表达的启36细胞器特异启动子 叶绿体基因工程：在叶绿体表达外源基因。优点：1）叶绿体基因组小，没有位置效应，转基因不会沉没；2）表达量高，可以达到10000叶绿体/细胞；3）花粉中没有叶绿体，所以没有基因逃逸，安全。Chloroplast transformation vectors most often include a light-responsive promoter psbA,a photosystem II promoter，and rbcL,the promoter for the ribulose

28、-1,5-bisphophate carboxylase large subunit gene,and the 16S rRNA(Prrn),a strong and constitutive plastid operon promoter.植物基因表达的启37叶绿体基因工程在植物抗虫、抗除草剂、生产药物蛋白方面具有极大的优势。研究表明，叶绿体基因工程培育的抗除草剂植物的抗性有时比核转基因的高10000倍植物基因表达的启383.诱导型启动子（诱导型启动子（Inducible Promoters）特异启动子是依靠植物自身的能力实现基因的不同时空表达，利用诱导型启动子则可以人们主动控制基因表达。3

29、.1 Stress/wound-inducible promoters：病原菌、害虫、低温、高温、水涝、干旱、高盐、创伤等都可以引起植物的一些特殊反应（基因表达的结果），由此而得到一些受这些因素诱导的启动子。马铃薯创伤启动子 wun1（创伤启动子）and proteinase inhibitor II(pin2，蛋白酶抑制剂)gene promoters both direct high wound-and pathogen-inducible expression,but have little to no constitutive expression without stimulus。T

30、he 1.2 kb wun1 promoter fused to reporter genes showed very high levels of expression at the site of wounding and pathogen attack。Reporter gene induction was maximal at 10 h.The Arabidopsis rd29A and rd29B基因启动子受到干旱、高盐的诱导。植物基因表达的启393.2 外源诱导启动子系统 优点：1）可以随意控制（诱导时间和诱导的剂量）；2）重复控制；3）植物内部背景低。Most inducible

31、/repressible promoter systems are two-component systems with molecular on-off switches that vary in complexity.They include a transcription factor gene whose product,when selectively expressed,binds to a target promoter that contains the transcription factors cis-acting element.The target promoter i

32、s fused to the transgene of interest and the binding of the transcription factor modulates its expression 植物基因表达的启4035S启动子启动子转录因子基因转录因子基因转录因子转录因子+诱导剂（诱导剂（Cu2+,酒精酒精,等等)基因表达基因表达外源诱导启动子系统作用示意图外源诱导启动子系统作用示意图结合结合转录转录功能基因功能基因诱导型启动子诱导型启动子植物基因表达的启41 乙醇诱导系统:It is composed of the promoter of the alcohol dehyd

33、rogenase gene,alcA,and an alcohol activated transcription factor gene(alcR)driven by the CaMV 35S promoter.The transcription factor(ALCR)binds in the presence of ethanol to specific sites in a chimeric alcA:CaMV 35S minimal promoter(TATA box region),activating transcription of a target gene.The alc

34、system is extremely sensitive to ethanol and is induced rapidly and in a dose-dependent manner.The target gene is induced by soil root drenching(0.5%v/v ethanol),hydroponics(0.1%v/v ethanol),and foliar spraying of mature plants(5%v/v ethanol).It has low to no basal expression of the target gene,and

35、it has the advantage of an inducer that is inexpensive and nontoxic at the effective concentrations.Induction of target gene expression was similar to that of genes driven by the CaMV 35S promoter,but was reversible.One drawback is that under anaerobic conditions,plants that are known to express alc

36、ohol dehydrogenase are likely to activate this system with the production of ethanol,a fermentation metabolite.However,this system appears to be one of the most promising for use under field and commercial conditions.植物基因表达的启42Tetracycline and hormone-inducible systems 包括Tetracycline(四环素)inducible system,estrogen(雌激素)inducible system,ecdysone(蜕皮激素)inducible system,和glucocorticoid(糖皮质激素)-based system.植物基因表达的启43启动子的分析1.启动子需要多长(bp)?2.启动子长短与其作用强弱的、细胞、组织、器官特异性密切相关。3.同一启动子在不同植物中作用常常是不一样的。35S启动子的作用在双子叶植物中的效果好，在单子叶植物中常较差，在菊花中几乎没有作用；双子叶植物和单子叶植物来源的启动子在相同类型植物中效果比较好。植物基因表达的启44