组蛋白的一维SDS

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1、简介作用原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝 胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的 形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由 shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原 剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可 以忽略电荷因素)。二作用SDS是阴离子

2、去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使 分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半 胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链， 解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的 电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨 率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上, 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选T

3、RIS/HCI 缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCI解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘 氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最 慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而 电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动, 形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子 形状无关。三补充信息聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE(Polyacrylamide gel electrophore

4、sis)聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯 酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化 聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以 四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后 者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形 成三维网状结构PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连 续系统

5、中由于缓冲液离子成分，pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中 泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均 较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合 而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCI。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶， 凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCI。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连 续性，这是样品浓缩的主要因素。四.过程蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率

6、取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小， 就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基 硫酸钠(SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质 分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同 密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原 有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合物形成近似 雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，

7、约为18A(1A=10的 负十次方米)，这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和 形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上带有相等的电 荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的 分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快;大分子蛋白 质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而 被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD 到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式:logMW=

8、K-bX, 式中:MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率 对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的 电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在 SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成 分别对应于各个亚基的几条带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要 不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于 了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。五常见问题1.配胶缓

9、冲液系统对电泳的影响？在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环 境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高， 两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度 成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄 的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率 增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白

10、分子根 据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很 好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带 有烷基化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT（或作巯基乙醇）后，蛋白质构象被 解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一 般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5mi n,再 离心加样。2

11、）带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的 保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。 100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3）非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min, 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳 成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.

12、8,选择Tris-HCl系统，TEMED与 AP:AP催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝剂，加 速AP催化作用;十二烷基磺酸钠（SDS）:阴离子去污剂，作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白 质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后，可在 室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可 导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又

13、各自不同的染色方 法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。5微笑（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法:待其充分凝固再作后续实验。6皱眉（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法:可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7.为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。此外可能是灌胶时分离胶过多导 致浓缩胶很少，不能起到浓缩作用，没有把样品压成一条线。处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间

14、过 长，重新配制;降低凝胶浓度;灌胶时分离胶不要过多。8为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。9什么是鬼带”，如何处理？鬼带就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶 中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而 失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子， 其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性, 在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法:在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，

15、以补充不足的还原剂; 或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓 冲液和分离胶的浓度有关。处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）;适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于 电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括a内外槽装反;b 外槽

16、液过少;c.电泳槽底部的 绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法:电泳槽正确装配即可。13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力 不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。14凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。 APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和 TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15.电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲

17、系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物 质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。16分离胶加上后为什么要立即加水？加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把 它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。17连续分离胶体系配制（凝胶板厚度0.75mm，长度10cm）100ml体系:双蒸水37.5ml 尿素 20-50g10xTBE缓冲液8ml30%丙烯酰胺10mlAPS（过硫酸铵）500-800ul 注:现配现用TEMED（四甲基乙二胺）23.5ul六原理1聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（以后简称单

18、体）在水溶液中聚合而成的亲水性高 聚物，是一种透明而不溶于水并有韧性的凝胶。2制备凝胶时需要的原料是:丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺（双体，用作交联剂）0在水溶 液中用催化剂引发聚合。常用的催化剂有:二甲氨基丙腈（DMAPN）;过硫酸铵，四甲基乙二 胺;过硫酸铵或加核黄素后用紫外光（波长253.7毫微米）引发聚合。3聚合时丙烯酰胺分子通过加成反应形成长链，双体的作用是在长链之间形成交联， 成为具有三维网状结构的凝胶（见图1）。所以在凝胶电泳中除了具有电泳的分离外还具有分 子筛作用，从而增高了它的分辨能力。4聚合时，根据分离的需要，可以用改变单体溶液浓度或增减双体比例的办法制成孔 度大小不同的凝胶。

19、在分离血清蛋白时，我们采用的丙烯酰胺总浓度为6.5%，内含单体 96%,双休 4 5刍仃 一 6.5，c 一 4%）。5聚合物分子中含有很多酰胺基，所以凝胶具有良好的亲水性，能在水中溶胀但不溶 解。七.实验材料一. 设备进行凝胶电泳的装置见图版4。1）直流电源如果一次进行电泳的管数在20管以内可以用最大电流300毫安的整流器 （硅或硒整流器），调压范围0-300伏。2）电泳装置包括二个缓冲液槽和电泳管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部钻孔。 插入电泳管，用有孔橡皮塞固定。电泳管选用孔径均匀一致的玻璃管切制。长 10厘米，内 径A5毫米。脱色用玻璃管长10厘米，内径8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及

20、橡皮圈套住 底部。3）凝胶管架灌装凝胶管时使管保持垂直位置，用有机玻璃制成。二. 操作方法1）凝胶管的制备将电泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝胶溶液（方法见下 文）。每管加至液体高度为7.5厘米。为了保证凝胶表面平整可用注射器通过细针头小心地 加一层（高约1厘米）蒸馏水于表面上，勿使与凝胶液混合，室温放置。如果条件合适溶液于 30-60分钟内聚合而成凝胶。凝胶溶液的配制方法如下:溶液甲:丙烯酰胺（氯仿重结晶）25 克, 双体（甲醇重结晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要时用三瓮甲基氨基甲烷调pH至7.0o 溶液乙:二甲氨基丙睛I毫升，三瓮甲基氨基甲烷0.85克（也可用0.625克氨

21、三乙醇或氨乙醇） 加水至100毫升。溶液丙:K3Fe（cN）6分析纯0.075克，加水至100毫升新配。用作阻聚剂 以延缓凝聚时间。使操作方便，如凝聚时间已足够长可以用蒸憎水代替。溶液丁:过硫酸钱（二 级）2.8克加水至100毫升新配。必要时用氨水调pH至7.0 c,溶液甲及乙配后可在冰箱 中保存数月。溶液丙及丁用时新配。临用前将溶液甲、乙、丙、丁等量混合。2）准备把已灌装凝胶的玻管通过有孔椽皮塞安装在上面液槽的底孔中，在上下两槽内 分别注入缓冲液。装上后电泳管下端应浸没在下槽的缓冲液中，管下端勿留气泡。血清电 泳可以用巴比妥缓冲液pH 一 8.6,离子强度0.05（配法:巴比妥钠10.3克，

22、二乙基巴比土酸 1.84克，加水至1升，温热使溶。加硫柳汞0.1克防霉）。3）加样在资料介绍的方法中，一般还在了这一步。在血清样品中加入少量蔗糖以增加 密度，用血红蛋白吸管直接小心地加在凝胶表面上，加样量一般为7微升血清。如果在样 品中混入少量漠酚兰指示剂就可以在电泳过程中观察前沿移动的情况。4）电泳在二液槽中安放钳金丝电极;正极在下，负极在上。接通电源进行电泳，电场强 度10伏/厘米左右，视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。 蛋白质向正极移动。侍染料前沿移动至管底近处，停止电流。电泳时间为1 一2小时。电 泳完毕取下凝胶管，用细长针头沿管壁注蒸憎水，使凝胶与管壁剥开

23、。然后用橡皮球压出 凝胶条。5）染色及脫色电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小时以 上。染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。置于脫色玻管中，在同一电泳装置中电解脫色。 此时改用7%醋酸充装在液槽中。通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后 的另一层凝胶中（图2）。在我们的试验中省略的染料泳向正极。脫色时电场强度25伏/厘米， 电流10-1 5毫安/管。3-4小时脫色完毕。增高电压可以加速脫色。有色的醋酸溶液通过盛 有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。6）保存与记录脫色后的凝胶可以装在盛有7%醋酸的有塞试管中保存数年。也可以自然 干燥后保存，在需要观察时

24、再浸在7%醋酸中溶胀成原来形状。记录可以用照相摄影。也可 以用光密度计进行捕记。光密度计的分辨力决定于其狭缝宽窄及光电管放大倍数。三、实验结果1.电泳条件的选择为了选择血清蛋白电泳较合适的条件，我们分别对单体浓度、双体浓度、配制凝胶时 所用不同正离子、各种电压、二甲氨基丙月青的浓度、过硫酸钱的浓度等条件进行了试验。 根据以上试验结果，我们在分离血清蛋白时选用的条件是:单体浓度6.25-6.5%,双体占总 丙烯酰胺量的4-5%,正离子采用三瓮甲基氨基甲烷，二甲氨基丙青及过硫酸钱浓度分别为 0.25%及0.7%。电泳电压以7-10伏/厘米较为合适。但电泳时间较长，约2-3小时，室温 低时可以电压稍

25、高。如果室温较高则可以在冰箱中进行电泳。2人血清及其酒精分划部分的凝胶电泳采用上述条件我们进行了正常人血清的凝胶电泳。一般可以分成15-20条区带。我们 也根据RaFmand介绍的两向电泳方法比较了纸电泳和凝胶电泳各区带的相对关系。纸电 泳上的a:区带在凝胶电泳中可被分离成10条以上区带。但纸电泳中d,区带的一部分则与 凝胶电泳中自蛋白区带相重合。二种电泳方法所得的图谱见图版9。在正常人血清中后白 蚤白(PA)、转铁蛋白(Tr)和触珠蛋白(HP )均有不同的型，一例骨髓瘤病人血清的和凝胶电 泳自由电泳图谱的比较见图版11、12。我们也比较了酒精分划人血浆各部分的纸电泳和凝 胶电泳图谱，结果见图

26、版13。从图中可见在纸上电泳检定时看来较纯晦白蛋白和丙种球蛋 白部分，在凝胶电泳中可见明显的其他蛋白区带。3. 放射病狗血清蛋白电泳的观察放射病动物血清蛋白的改变可以在纸电泳中观察到。 一般认为狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝胶电泳观察可以得到更深入的资料。正常狗血 清的凝胶电泳图谱大致与人相似。狗受致死量照射后第九天有明显变化，至极期时则可 以观察到鸭、Tr、融及sp等区带有明显增高。我们用胎3-10型光 谱仪用光密度计将电泳 图谱进行了扫描，所得结果见图3,图版14。由于仪器的限制光缝最小只能达到0.5毫 米，从而影响了其分辨力。但与正常血清对比可以见到其改变的情况，这远比纸电泳中所 见更为

27、明显。我们认为如果联系临床表现对变化的本质进行一些研究，将有助于了解放 射病极期来到前后体内蛋白质代谢的一些情况。4. 在分离正常人尿DNase时的凝胶电泳 观察用葡聚糖凝胶分离人尿中DNase时可 以除去大部分其他蛋白质和杂质。但分离所得的制品用凝胶电泳观察还可以见到五条以上 的蛋白质区带(见图版14)。将凝胶条在未染色前置于含大分子DNA的琼脂平板上，在37c 温箱中保温2-3小时，再用5%三氯醋酸加至如此处理过的琼脂板上，可以看到乳白色本底 上出现被酶水解后的透明斑点。将凝胶条用氨黑染色后显示其蛋白区带的位置。二者比较 就可以确定具有酶活性的成分的相应电泳位置。我们的试验中观察到人尿DNase在凝胶电 泳中至少被分离成二条以上有酶活性的区带。说明有同功酶的可能。应用这一方法可以较 深人地观察体液中酶的情况。同时也说明可以用凝胶电泳来指示生物制剂制备过程中纯化 的情况。八结论本文介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的一些初步实验条件和实验结果，并与纸电泳、自由 电泳等进行了对比。从结果中可以看到聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力较强，重演性良好。 它在临床生化分析及生物活性物质的分离、制备中和纯度鉴定中具有较广泛应用的可能性。