细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

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1、细胞内细胞因子的流式细胞仪检测点击次数：621作者：佚名发表于：2008-07-24 15:51转载请注明来自丁香园来源：51protocol一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子 的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达 手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析(limiting dilution analysis，LDA)和单 细胞PCR,应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2 细胞，此方法可获得较强的细胞内信号

2、，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼 识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。 随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。 下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴 细胞克隆)与TH2 (IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆克隆证明了不 同细胞因子的合成，如TH1 (IL-2，IFN-克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。近来，Jung 与 Pi

3、cker采用了 monensin、PMA等药物预孵，用 Brefeldin (BFA)、Monensin 阻断 了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因 为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过 程中， T 淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测 单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋 巴细胞都存在1 型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚

4、群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群 细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具 有其它方法难以比拟的优点：快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需 6-8 小时，实际操作时间为 1-2 小时，快速简便；简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参

5、数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。二、所需仪器1、流式上样管及细胞培养皿或板2、25%CO2 37C孵箱3、混匀振荡器4、离心机5、加样器、 Tips6、流式细胞仪三、常用的标本类型和处理方法全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时 内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测， 应将真空采血管水平室温放置。自身血浆中外周血单个核细胞（PBMCs）:使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs, 24小时内分 析。组织培养基

6、中的外周血单个核细胞（PBMCs）:用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭 活胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，调节细胞浓度为2x106细胞/ml。调节细胞浓度2x106细胞/mL于新鲜培养基中。冰冻全血与PBMCs：使用1x红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1% 的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，一70C冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上23mL的洗液， 离心 5 分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。四、所需试剂1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要选择特殊表面标志CD45 圈定所有淋巴细胞CD3圈定T淋巴细胞CD

7、4圈定T辅助淋巴细胞亚群CD8圈定T抑制淋巴细胞亚群CD19/或CD20圈定B淋巴细胞CD56圈定NK淋巴细胞CD14圈定单核细胞2、荧光标记的细胞因子抗体R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体3、溶血素用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞4、激活剂 Phorbol 12-Myristate 13 Acetate （PMA）（ Alexis,目录号 ALX-445-004-M001）DMSO中调节浓度0.1mg/mLL）,20C储存。勿反复冻融分装（20每次实验用无菌无叠氮钠PB

8、S 1： 100稀释储存液D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液 lonomycin （Alexis,目录号 ALX-450-006-M001）于乙醇中配制成浓度 0.5mg/mL20 C储存每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1： 10稀释储存液g/mL细胞悬液卩lonomycin终浓度1Staphylococcal enterotoxin B( SEB)( Sigma， Catalog No.S-4881 )无菌无叠氮钠 PBS 调节浓度 0.5mg/mL4C储存g/mL细胞悬液pSEB终浓度10 CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞 CD28：加速不同刺激剂(包括

9、SEB、CD3等)的活化效应，浓度一般为10ug/ml5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内 Brefeldin-A (BFA)(eBioscience,目录号 00-4506)于 DMSO 中调节浓度 5mg/mL分装(20L), -20C储存。勿反复冻融。每次实验用无菌无叠氮钠 PBS 1：10稀释储存液g/mL细胞悬液。激活最后45小时BFA终浓度10注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降 Monensin （eBioscience，目录号 00-4505）6、 不含谷氨酰胺的 RPMI-16407、固定剂 细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的

10、目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience,目录号00-8222）8、破膜剂含 1%皂貳、0.05%叠氮化钠的 Hanks 溶液（HBBS）（eBioscience，目录号 00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合9、其它试剂无菌无叠氮钠PBS,乙醇，含1%多聚甲醛的PBS, 4C储存。五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激 剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测

11、一些常用细胞因子的推荐的活化方法。表 1 、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法检测细胞因子阳性对照刺激方法人 IFN-g方法2 （4-24小时）人 TIMP-1方法5人 aTNF-方法7 （6小时）人 IL-1a方法3 （6小时）人卩IL-1方法3 （24小时）人 IL-2方法2 （4-24小时）人 IL-4方法4人 IL-5方法1人 IL-6单核细胞：方法3 （6-12小时）T细胞：方法6人IL-10方法1人IL-12方法8人 IL-8/CXCL8人 MCP-1/CCL2人 MIP-1a/CCL3人 MIP-1b/CCL4人 RANTES/CCL5小鼠IL-2小鼠IL-4小鼠IL-

12、5小鼠IL-6小鼠yIFN小鼠aTNF-方法3 （24小时）方法3 （24小时）方法3 （24小时）方法3 （24小时）方法1方法9方法10方法10方法11方法9 or方法12方法9为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂（如3uMmonensin， 10mg/ml 的 BFA）方法 1 ：只使用转染细胞检测方法 2：人的 PBMCs 使用 PMA （10 ng/ml）和 lonomycin （1 uM）刺激 4-24 小时.方法3：人的PBMC使用LPS （0.5 - 1 ug/ml）刺激24小时.方法4：人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人C

13、D3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml， 目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗 涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA（10 ng/ml）和Ion omycin （ 1 uM）刺激6小时20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（细胞浓度维持在2x106 /mL） 混匀，室温暗处孵育15分钟；方法 5： CD4 T 细胞使用 PHA （10 ng/ml） 刺激 4 days方法6： T细胞使用抗CD3的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1

14、b （Lorre, et al., 1994，Clin Immuno Immunopath 70:1 ）方法 7： 使用 PMA （50 ng/ml）和 Ionomycin （500 ng/ml）刺激（10 ng/ml，目录号 285-IF-100）刺激 2 小时，然后使用 IFN（10 ng/ml） LPS（1 方法&PBMCs细胞使用重组人IFN ug/ml）刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1细胞.方法9： EL4在包被抗小鼠CD3抗体（25 ug/ml）的培养板中，使用抗CD28抗体（2 ug/ml）PMA（5ng/ml） Ionomycin（500 ng/ml） 刺激 6 小

15、时方法10： CD4+T细胞在包被小鼠CD3 （25ug/ ml）抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28 （2ug/ml）的抗体，重组小鼠的 IL-2 （10 ng/ml，目录号 402-ML-020）和 IL-4 （50 ng/ml， 目录号 404-ML -005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使 用 PMA （5 ng/ml）、Ionomycin （500 ng/ml）和 monensin 刺激 6 小时。方法11:小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS刺激24小时方法12：小鼠脾细胞使用PMA （5

16、ng/ml）和Ionomycin （500 ng/ml）刺激6小时六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）1、收获细胞肝素钠抗凝的静脉血，按 1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37C, 5%二氧化碳培养4-6小时2、阻断Fc受体用于消除非特异性的结合染色 在小鼠，可使用纯化的Fcll/lll受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲 液中4C孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。 对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化lg或者血清进行阻断3、细胞表面染色 加适当的细胞表面染色试剂 加入

17、溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。） 离心500g 5分钟，弃上清4、固定和破膜 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清； 加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。加25、细胞内染色 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育 30 分钟。LPBS上机或加入500 L 1% PFA固定后再上机加2、3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清, 加入 500七、注意事项1、标本处理避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。 此外LPS

18、，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析， 超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空 采血管水平室温放置。2、刺激激活 检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN- y则可选择PMA和lonomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗 原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分 析3、选择合适的对照为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：未刺激对照激活时由于BF

19、A的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含 BFA。 激活对照激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出 了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。同型对照使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特 异性结合到细胞表面而产生的背景染色。4、Fc 受体阻断使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32 （eBi oscience，目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化

20、的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化 Ig 或血清。5、荧光素的选择检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用P E或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞 因子如IFN- y。八、问题与解答无CD69胞内染色细胞未激活激活剂制备不当，见激活剂制备储存一节。PMA lonomycin 激活 4 小 时后CD3 T淋巴细胞CD69阳性 率应90%使用了错误的抗凝剂应使用肝素钠，不要使用肝素 锂，避免使用ACD与EDTA等络合 钙的抗凝剂。淋巴细胞激活需要Ca,络合Ca的抗凝剂会影响激活。细胞未通透在使用通透液前先使用溶血素溶血素辅助细胞通透BFA失活或制备不当详见BFA制备BFA于-20C储存详见BFA制备胞内染色阳性但很弱抗细胞因子抗体浓度不对按R&D推荐量使用荧光抗体正常的激活T