酵母发酵酒精的研究进展

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1、酵母发酵酒精的研究进展 （生命科学与技术学院 微生物专业 ）前言人类利用酵母菌的历史已有几千年了。值得提出来的是，早在我国宋代的酿酒著作中，中国人已经明确记载了从发酵旺盛的酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（当然不是纯粹的酵母菌）的方法，并把它们称为“酵”，风干以后制成的“干酵”可以长期保存。这种制造干酵母的原始方法说明，早在800年前，中国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长的物质引起的。这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。明代末年出版的词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。这说明至少在那时，一引起细心观察自然现象和注意比较的学者，已经认识到发面和酿酒有某种相同

2、的因素在起作用。当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在200年后才知道酵母菌的作用。今天我们把这类微生物称酵母菌，正是以此为根据的。酵母菌能够把糖变成酒精，是因为它的细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞的催化剂在科学上叫做酶。虽然现在知道所有的生物都是靠酶催化的化学反应来生活的，但最早发现的酶，就是酵母菌的酶。酵母菌中最早发现的酶，是把糖变成酒精的一群酶，当时自然数酒化酶。由于这种酶的作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是利用酵母菌酿酒和发面包的原理。使面团产生许多空隙的就是二氧化碳。酵母细胞大小为2.5-10m4.5-21m, 在加盖的玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型的假菌丝, 营养细胞可直接变

3、为子囊, 每囊有1-4个圆形光面的子囊孢子, 在麦芽汁25培养3d, 细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色, 有光泽, 平坦, 边缘整齐。菌体维生素、蛋白质含量高, 既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖, 但不能发酵乳糖和蜜二糖, 不同化硝酸盐。酵母菌的繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸的真核微生物。单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。酿酒酵母基因组共有

4、5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因/2kb，密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。酿酒酵母是最小的真核基因组，裂殖酵母其次，其密度是1/2.3kb，简单多细胞生物线虫的基因密度为1/30kb。第二、酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。1、酵母的生长条件1.1 无机盐无机盐类是微生物生命活动不可缺少的物质, 其主要功能是参与构成菌体成分、作为酶的组成部分, 或维持酶的活性、调节渗透压等。王蓬际8(2005)在完全合成培养基条件下,就硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二氨3 种无机盐对1 株产高浓度酒精的酿酒酵母A12

5、( 大连轻工业学院菌种保藏室保藏) 的间歇发酵影响进行了初步研究, 得到了不同无机盐浓度与最终酒精浓度之间的关系, 初步找到了该株酵母所需无机盐的临界值: 硫酸镁5g/L; 磷酸二氢钾为5g/L(或5g/L); 磷酸氢二氨为5g/L。并指出该株酵母发酵时间仍然过长。但对硫酸镁浓度较高时对酵母发酵的抑制作用未做深入研究。1.2 碳源、氮源的吸收与利用氮源是构成菌体物质和一些代谢产物的必需营养元素,定性和定量地分析了两种酿酒酵母发酵前期在不同含氧条件下利用和吸收氮源的差异, 这些差异主要受发酵前期氧和酿酒酵母的影响, 在后发酵阶段, 通过NAD(P)H再氧化释放氨基酸来保持氧化还原平衡。王蓬际比较

6、了尿素和硫酸铵两种氮源对A12 发酵的影响, 发现硫酸铵比尿素较好, 最终酒精浓度可以达到119.9g/L。1.3 碳源、氮源缺乏的影响S.cerevisiae 与碳源、氮源的关系,目前的研究主要集中在吸收与利用上, 碳源、氮源缺乏对S.cerevisiae 的影响却很少有人研究, Elisabeth Thomsson 等针对碳源、氮源缺乏对S.cerevisiae 的影响进行了连续研究。2003 年的研究显示, 缺氮培养后, 发酵能力依菌株不同减少70%95%, 缺碳培养后, 几乎所有供试菌株都丧失了发酵能力。2005 年发现碳( 非氮) 缺乏对发酵性能的影响取决于缺乏培养前的生长条件。而氮

7、缺乏培养后所有供试菌均保持了大部份原有的发酵能力, 与缺乏培养前的生长条件无关。氮缺陷型菌株在碳缺乏培养后, 丧失了大部分发酵能力。碳缺陷型菌株在碳缺乏培养后仍保持大部分发酵能力。碳缺乏培养前葡萄糖含量与碳缺乏培养后的发酵性能、胞内ATP 含量存在相互关而发酵力与葡萄糖的吸收率没有相关性。并指出在工业发酵中, 在厌氧条件下为保持酿酒酵母发酵能力强的菌株数量, 应避免酵母菌株碳源缺乏。2、酵母发酵酒精技术的研究进展2.1 混合菌种发酵葡萄酒的传统自然发酵工艺一般采用混合菌种发酵。朱一松用Debaryomyces vanriji 和S. cerevisiae 的混合培养发酵来生产葡萄酒, 发现混合

8、培养比纯培养得到的- 葡萄糖苷酶的活性更高, 发酵后的葡萄酒中脂肪酸、酯、萜烯醇等的含量更丰富, 从而改善了葡萄酒的风味。南阳1308酵母混合发酵能解决酒精产率不高和有机酸等副产物的存在问题。2.2 固定化酵母技术固定化细胞技术是现代生物工程技术的重点内容之一,它是运用物理或化学的手段将游离的细胞定位于限定的空间区域, 使其保持催化活力, 并可反复使用。目前, 已对包埋剂和控制技术参数等取得了一定的科研成果。廖朝晖以陶瓷为载体的实验中发现, 采用陶瓷固定技术比藻酸钙固定化的技术要好, 其原因可能是陶瓷载体较重, 能保护S. cerevisiae 细胞及其生理活性, 使S. cerevisiae

9、对糖和酒精体现出较高的耐受能力。空心柱状的载体材料比实心球状的载体材料速度要快, 小颗粒载体速度最快, 但影响系数并不是最高。Mansour对S. cerevisiae 中的转化酶用硅藻土和聚丙烯酰胺固定的研究表明, 硅藻土(celite)固定比聚丙烯酰胺固定有更好的稳定性。在最佳温度60, 最佳pH4.6 时, 其转化酶的活性分别为92%和81%。并且pH在4.0-6.5 和温度40-60范围内, 在室温下贮藏90d 和重复使用20 个批次后仍有特别好的稳定性。侯红萍等采用海藻酸钠包埋法和明胶包埋法, 通过对比重复试验, 发现用6%明胶-戊二醛为包埋剂固定酿酒酵母和生香酵母的方法较好。固定化

10、的最佳方法是: 取40mL6%明胶、1.0g 酿酒酵母湿菌体和1.5%的生香活性干酵母混合包埋后, 再用1.5%戊二醛溶液交联3h。固定化酵母菌的最适糖化发酵时间为9d。固定化酵母比游离酵母发酵速度快, 出酒率提高了2.2%, 产酯量提高了20%。连续使用10 个批次后, 其机械强度良好, 酿酒性能稳定2.3 浓醪酒糟发酵国内传统发酵法酒精工业已有近一个世纪的发展历程，生产上酒精出率已经达到国际的先进水平，从生产消耗、能耗及发酵强度方面看仍具有很大的潜力；这要以先进的工艺为依据。于1995年底，成功研究的“酒精浓醪发酵工艺”具有设备利用率高、能源消耗低和酒糟处理量少等一系列明显的优点。 原料经

11、精选、除杂（玉米经脱皮、去胚）后粉碎，通过低温蒸煮（双酶法）液化、糖化和浓醪间歇发酵后，发酵成熟醪中的酒精浓度可达14%16%（v/v）；发酵温度3037，发酵时间在50小时之内，淀粉利用率达90%。3、新型酵母菌株的研究进展3.1 诱变育种诱变的机理是：碱基置换：又分为转换和颠换。DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被一个嘧啶置换称为转换；一个嘌呤被一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤置换的称为颠换。移码突变和染色体畸变。 用于酵母变育种的理化因素有：1、物理诱变剂，如紫外线、射线(60Co照射)、 X射线、离子束、质子、激光、微波、电磁波、空间辐射等。2、化学诱变剂。(1)烷化剂类化合物，

12、如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二乙基亚硝胺(DEN)、乙基磺酸甲酯(EMS)、重氮甲烷、乙烯亚胺、氮芥等。(2)碱基类似物，如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶(5-AU)等。(3)移码诱变剂：吖啶黄、吖啶橙等吖啶类化合物。(4)脱氨基诱变剂：亚硝酸。利用诱变育种方法已经筛选到很多种工业酿酒酵母。 3.2 原生质体的融合原生质体融合技术广泛应用于各类微生物遗传育种中, 单亲灭活原生质体融合技术的最大优点, 就是可以省去亲株细胞的遗传标记和提高筛选效率，也可通过双亲灭火或抗性筛选方法建立筛选体系。目前的生料发酵仍需添加糖化酶系, 构建可降解淀粉直接发酵酒精的菌

13、株则可不必添加糖化酶而直接发酵, 不仅可以缩短工艺过程, 而且可以节约设备和投资, 增强了市场竞争力。张华山通过酵母属间融合成功地构建了直接转化淀粉生产燃料酒精的新型菌株。文铁桥通过PEG诱导碘乙酸灭火呼吸缺陷克鲁维酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合，获得45发酵产酒率高达8.7%的高温酵母菌株。毛华等人利用原生质体融合技术进行属间融合,得到能发酵木糖产生乙醇的酵母菌融合子。细胞原生质体拆合技术是在细胞融合基础上、结合了基因工程技术而发展起来的一项新兴技术。林炜铁选择具有耐高温(42)、耐高酒精度(15)特性的K氏酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞核，与耐高糖(

14、55)的H15蜂蜜酵母(Nectaromyces sp)经紫外线灭活的无核原生质体，进行原生质体拆合技术的研究，建立一条遗传育种的新型途径，为工业微生物育种提供了一个新的方法，并构造细胞核转移和真核细胞无核系统的实验模型。 3.3 外源基因在酵母中的表达国外对糖酵解途进中的3个激酶及14个相关基因进行过量表达研究表明对产酒率和酒精耐受性都没有明显变化。酒糟中存在着一些未能被酵母消耗的糖，含量较高的如纤维二糖、蜜二糖等，有效利用酒精发酵过程中产生的纤维二糖，具有一定理论和实际意义。采用异硫氰酸胍酚氯仿法提取里氏木霉总RNA，分离polyA+mRNA2;通过RT-PCR方法扩增得到葡萄糖苷酶基因。

15、构建了重组质粒Pyx-BGL，并在酿酒酵母中获得表达，得到的转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长。虽然半纤维素多聚体的降解比较容易,但其降解产物戊糖(主要是木糖) 发酵产生乙醇则要比纤维素的降解产物葡萄糖的发酵困难得多。将P. stipitis 的基因XYL1 和基因XYL2 克隆于多拷贝载体在酿酒酵母启动子如PGK、ADHI ,或在其自身的启动子下,均可以在酿酒酵母菌中得到较高的酶活表达。但所构建的表达XYL1 和XYL2 的酿酒酵母重组菌株,尚不能发酵木糖产生乙醇,消耗少量木糖主要被还原为木糖醇以及其他副产物。这被认为是反应平衡常数的特点所致,XR 的酶促反应,木糖+ NADPH + H+ 木

16、糖醇+ NADP+ 的平衡常数Keq为5175 109mol/ L ,XDH 的酶促反应,木糖醇+ NAD+木酮糖+NADH + H+ 的Keq为619 10 - 11mol/ L ,表明这两步可逆反应倾向形成木糖醇。此外,两步反应的辅酶(NADPH 和NAD+ ) 不能偶联,造成细胞内氧化还原失衡,也是引起木糖醇积累的原因之一。仅仅表达XYL1 和XYL2 基因尚不能使酿酒酵母重组菌株发酵木糖产生乙醇,推测是木糖到乙醇整个代谢途径上的其他环节有障碍。转酮酶(TKL) 和转醛酶(TAL) 是PPP途径上的关键酶,酿酒酵母菌含有这两种酶,但酶活较低。转酮酶是组成酶,已从酿酒酵母中克隆得到2 个转

17、酮酶的基因TKL1 和TKL2 。研究结果表明TKL1 对木酮糖的代谢影响较大。酿酒酵母的转醛酶基因TAL1 也已克隆得到。酿酒酵母菌株在木酮糖上生长时大量积累72磷酸景天庚酮糖,这一结果暗示着转醛酶是酿酒酵母通过PPP 途径代谢木酮糖的限制因素。木糖转化为木酮糖的另一途径是通过细菌的木糖异构酶,该酶一步完成木糖向木酮糖的转化,并且不需要任何辅助因子,因而被认为是构建利用木糖酿酒酵母代谢工程菌株的便利途径。编码该酶的基因xylA 曾先后从E. coli , Actinoplanes missouriensis , Bacillus subtilis , 和L actobacillus pent

18、osus 克隆得到,上述不同来源的xylA 基因分别克隆于酿酒酵母菌的GAL1、PDC1、PGK1 和ADH1 启动子下,转化于酿酒酵母菌中,但以上各种来源的xylA 基因在酿酒酵母菌中均没得到活性表达。由于Thermus thermophilus 的木糖异构酶基因xylA 在茄科植物细胞中得到表达,本课题组采用PCR 技术从该菌克隆得到xylA 基因。转化酿酒酵母,首次成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达。为了使木糖代谢流向乙醇形成的方向,在酵母转化子中又引入磷酸戊糖途径中的转酮酶基因TKL及转醛酶基因TAL1 ,同时表达xylA 和超表达TAL1 基因、TKL1 基因的酿酒酵母工程菌

19、株可以在木糖为唯一碳源的平板上生长;摇瓶发酵实验结果表明,该工程菌株可以发酵木糖形成113g/ L 乙醇。这一结果表明在酿酒酵母菌中建立了一条新的木糖代谢途径。3.4 基因敲处CreP-loxP 系统共转化法可用来敲除抑制乙醇生物合成的基因,同时也可用于过量表达促进乙醇生物合成的相关基因，进一步提高乙醇产量。乙醇脱氢酶是酿酒酵母乙醇代谢分解的关键酶。敲除编码乙醇脱氢酶的基因可有效地降低酵母的乙醇分解代谢活性,提高酵母细胞合成乙醇的能力。以PCR 为基础的基因敲除方法,尤其是loxP-Marker-loxP 序列组件和CreP-loxP 系统准确易行,已被广泛应用于酵母功能基因的分析。黄建忠等通

20、过敲除sfa1 基因提高酿酒酵母乙醇合成能力。周建中等采用醋酸锂转化法,将一段目的基因转入到酵母体内,破坏酵母PEP4 基因的表达。通过对目的基因的扩增和羧肽酶Y酶活检测验证基因敲除情况,并通过传代抗性试验与传代发酵稳定性实验验证突变株遗传稳定性良好。3.5 代谢合成网络调控和重建全转录工程方法( global transcription machineryengineering ,gTME) 是根据转录水平调控的全局性进行生物生理表型改造的方法。由于细胞的大部分表型是受多个基因控制的,要想得到某一特定的表型必须同时对多个基因进行修饰,这在很多情况下是难以完成的,因此转录水平的调控能够有效地得

21、到需要的表型。该方法一般通过改变几个影响全局转录的关键蛋白(经由“易错PCR”) 来造成多基因转录水平的改变,进而通过筛选可得到带有目的表型的突变株,然后通过比较出发菌株和突变菌株的转录谱可望得到与该表型相关的基因。针对生物乙醇研究中面临的乙醇和葡萄糖耐受性这一问题,Alper等利用gTME 方法,通过易错PCR 改变酵母中调节启动子特异性的主要DNA 结合蛋白spt15p 和TAF25 的编码基因,构建了两个gTME 突变文库,利用选择压力从中筛选出乙醇和葡萄糖耐受性提高的突变菌株spt15-300。比较转录谱研究显示,在非选择压力下,spt15-300 中有好几百个基因的表达水平同出发菌株

22、不同,敲除其中14 个表达量最高的基因中的任何一个都会导致菌株耐受性的降低,而且将其中表达量最高的3 个基因分别在对照菌株中过量表达都不会造成菌株耐受性的提高。在原核生物大肠杆菌中,Alper 等利用gTME 方法对影响RNA 聚合酶同启动子结合能力的因子的编码基因rpoD进行突变,分别得到了乙醇耐受性提高。4 结论及展望近来的工业微生物技术针对传统微生物催化工业中的关键技术和热点问题,展开了更为细致和具体的研究,成为酒精工业发展的直接推动力。同时,基因组及代谢网络等基础研究在生物工艺方面的应用,使工业微生物技术从基因水平出发,在更多的微生物资源中寻找催化合成工具,在更深层次上探讨催化调控方法

23、,呈现出空前广阔的发展前景。参考文献1 罗立新. 细胞融合技术与应用M. 北京: 化学工业出版社,2004.2 庞小燕,构建直接发酵淀粉产生酒精的酵母融合菌株的研究J.生物工程报,3 NissenTL,SchulzeU,NielsenJ,et al.Fluxdistributions in anaerobic,g lucose-limited continuous cultivations ofS .cerevisiae J.Microbiol , 4 LarssonK,AnsellR,ErikssonP,et al.A gene encodingsn-glycerol-3- phosphat

24、e dehydrogenase (NAD+ ) complements an osmosensitive mutant of S accharomyces cerevisiaeJ . Mol Microbiol ,5 张博润, 蔡金科. 酵母菌属间原生质体融合获得能发酵乳糖生产酒精的融合体J. 微生物学报6 蔡金科，刘玉方，张博润，1985. 酵母菌杂交育种.微生物学报7 Maitreya T , Takegawa K. Yeast , 2004 , 8 Harju S , Fedosyuk H , Peterson KR. BMCBiotechnology , 2004 9 Fletcher

25、 T S ,Kwee I L ,Nakada T et al . Biochemistry ,1992 10 Sundstrom M ,Lindqvist Y,SchneiderG et al . J Biol Chem ,1993 11 Schaaff2Gerstenschlager,MannhauptLG,Vetter et al.Biochem ,1993 12 Schaaff2Gerstenschlager,MiosgaT.Biores Technol ,1994 ,13 Schaaff,HohmannS,Zimmermann F K,European Biochem ,199014 Alper H,MoxleyJ ,Stephanopoulos G,et al.Science,2006 15 Alper H,Stephanopoulos G. Metab. Eng.2007