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1、药用蚶的活性蛋白成分及药理作用研究 - 医药学 医药学论文活性蛋白魁蚶毛蚶泥蚶药理作用蚶,隶属于软体动物门双壳纲蚶目蚶科(Arcoidae),是一类富含血红蛋白的海洋经济贝类,在东亚和南亚地区有着悠久的食用和药用历史具有药用成效的蚶有三个基源:毛蚶属毛蚶(Arca subcrenata)魁蚶(A.inflate)和泥蚶(A.granosa)蚶栖息于海岸线附近的潮间带,主要分布于西太平洋印度洋海域的中国日本韩国菲律宾泰国及马来西亚等国家,在我国分布于山东半岛以南沿海其壳为传统中医祛痰药瓦楞子,生品具有消痰化瘀的成效;煅制品具有制酸止痛的成效其软体局部风味鲜美常用作食疗保健,具有消痰化积,软坚散结
2、的成效蚶的药用历史久远,最早可追溯到汉朝末年?名医别录记载:“魁蛤,味甘,平,无毒主治痿痹,泄痢,便脓血后辈医书对蚶的药用成效进行了更详细的记载,发现蚶还具有温中消食,润五脏,治消渴,起阳的成效蚶是临床根底扎实成效确切的海洋中药,运用现代科学伎俩进一步阐明其药效物质根底将有利于该药的研究应用,发明巨大的开发价值蚶药用功能成分的研究起步较晚,开展迟缓国外学者对蚶药用成分的研究很少,相关研究近乎空白国内的相关研究开始于20世纪90年代末,国内学者对蚶的活性化学成分和药理作用做出一些研究报道现代研究说明蚶的主要药效成分为蛋白类化合物,具有抗肿瘤抗菌抗氧化抗衰老等广泛的药理作用,但是目前得到明确鉴定的
3、活性蛋白化合物成分并不多,许多活性成分尚待确定海洋生物生长在高盐高压低温低光照寡营养的海洋环境中,产生了与陆地生物不同的代谢系统和机体防御系统,合成并积累了大量结构新颖功能独特的活性物质,如萜类多糖类聚醚类大环内酯类和蛋白类化合物近年来,海洋活性蛋白化合物凭借生物活性高特异性强药理活性广等独特优势成为了新药研发的新蓝海蚶作为成效确切的海洋中药,富含蛋白质,具有广大的药用功能蛋白的开发前景为此笔者结合本研究团队近期研究结果综述了国内外学者在其活性蛋白成分和药理作用研究情况,旨在为药用蚶的深入研究和开发利用提供科学参考1蚶活性蛋白成分蚶是一类高蛋白低脂肪的海洋贝类,粗蛋白含量到达14.8%,高于牡
4、蛎贻贝蛏和文蛤等其他海洋食品贝类蚶活性蛋白成分的研究,主要见于毛蚶魁蚶和泥蚶近年来,随着现代生化别离技术,尤其是适用于极性大分子的层析技术的快速开展,越来愈多的活性蛋白被别离纯化,但是蛋白结构解析仍然存在诸多困难高级结构解析需要使用先进的技术仪器,如冷冻电镜技术X射线晶体学技术等一级结构确实定相对简单,但也存在因为出现天然蛋白N端封闭的情况而无法得到全部氨基酸序列的情况因此,文献报道的天然蛋白一般只鉴定出一级结构(全部或局部氨基酸序列)和局部二级结构(-螺旋-折叠)的比例关系,不包括完全的空间构象另外,考虑到活性蛋白在生物体内丰度低,富集难度大,进一步增加了活性蛋白的纯化难度总体来讲,蛋白化合
5、物的别离纯化和表征往往比小分子化合物困难许多,数量远不及有机小分子化合物最近,蚶药效活性物质的研究进展加快,目前已别离得到35个活性蛋白化合物1.1毛蚶活性蛋白成分毛蚶体内含有抗肿瘤蛋白成分本研究团队最先报道毛蚶蛋白成分具有抗肿瘤作用,并利用离子交换层析和凝胶层析的办法别离得到2个蛋白化合物,相对分子量8.2kDa的G4-2和相对分子量16 kDa的G-6,其等电点分别为6.6和6.1经MTT实验发现,G4-2对HeLaHL-60KB肿瘤细胞系均具有明显的抑制作用,其IC50分别为22.946.1和57.7g/mL;另一蛋白化合物G-6只对HL-60肿瘤细胞系具有抑制作用,IC50为123.2
6、g/mL随后,我们又从毛蚶中别离得到一种对HeLa和HT-29细胞系具有显著抑杀作用的蛋白组分P2Chen等运用活性追踪的办法继续从P2组分中别离纯化,得到一个相对分子量20491Da等电点6.65,具有抗氧化抗肿瘤活性的蛋白化合物H3H3是不含糖基的蛋白化合物,经MALDI-TOF/TOF-MS和de novo测序,得到了H3的局部序列:ISMEDVEESRKNGMHSIDVNHDGKHRAYWADNT-YLM,KCMDLPYDVLDTGGKDRSSDKNTDLVDLFELDMVPDR-KNNECMNMIMDVIDTN,TAARPYYCSLDVNHDGAGLSMEDVE-EDK体外抗肿瘤实验
7、显示,H3具有显著的抗肿瘤活性,对3种人源肿瘤细胞HeLaHepG2HT-29具有显著的抑制活性,其IC50分别为10.810.110.5g/mL此外,冯婷和付莹等发现,毛蚶活性蛋白组分对A549HCT-116MCF-7BEL-7402肿瘤细胞也具有一定抑制作用除了抗肿瘤蛋白成分,毛蚶酶解物中还含有抗氧化活性蛋白成分王勇等利用凝胶柱层析从毛蚶中别离得到了抗氧化组分P3,其对DPPH自由基的去除作用到达EC 50 0.192 7mg/mL吴思聪等考察了不同提取办法对毛蚶抗氧化能力的影响,结果说明,提取物利用饱和硫酸铵沉淀法除去杂蛋白后,最大限度保存SOD酶,对超氧阴离子具有显著的去除作用肖湘等利
8、用硫酸铵分级盐析和柱层析的办法,从毛蚶中别离得到铜锌超氧化物歧化酶该酶由两个亚基组成,每个亚基含有一原子铜和一原子锌,相对分子量为28.8 kDa此外,Song等考察了3种水解酶和酶解条件,确定了碱性蛋白酶酶解产物抗氧化活性最高李婷菲等利用碱性蛋白酶水解毛蚶,在打消自由基活性指导下,利用离子交换层析凝胶过滤层析反相高效液相层析别离得到2种抗氧化肽A-Bg1A-Bh,2者皆具有一定的去除DPPH的功能此外,张亚南等尚从毛蚶中别离纯化出两种血红蛋白HbI和HbII,并克隆获得了组成血红蛋白的三个亚基HbIHbIIaHbIIb的全长cDNA序列通过酶活性检测发现,HbIHbII对L-DOPA儿茶酚对
9、苯二酚这3种底物具有类酚氧化酶活性荆昭等对毛蚶血红蛋白体外抑菌活性的研究显示,HbIHbII对3种革兰阳性菌,金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌和四联微球菌均具有抑菌作用进一步对毛蚶Hb抗菌机理的研究发现,2种血红蛋白的抑菌作用是通过产生可被超氧化物歧化酶特异性抑制的ROS而实现1.2魁蚶活性蛋白成分迄今,国内外学者已从魁蚶中别离得到8种具有不同生物活性的蛋白化合物,其中5种蛋白与抗菌活性有关Li等通过魁蚶EST标签和RACE技术鉴定出一种魁蚶防御素Sb-BDef1RT-PCR结果显示,Sb-BDef1在魁蚶组织中均有分布在鳗弧菌刺激8h后,Sb-BDef1在魁蚶血淋巴中的叙述显著上调;16h后,Sb
10、-BDef1在魁蚶肝脏中明显增多这些结果揭示Sb-BDef1在革兰阴性菌侵袭机体时,发挥了免疫防御剂的功能Mao等利用EST标签和RACE技术从魁蚶中鉴定出一种脂多糖结合的杀菌蛋白Sb-BPI/LBP1Sb-BPI/LBP1由463个氨基酸组成,N端包含一个可与脂多糖结合的BPI1结构域通过RT-PCR检测发现,Sb-BPI/LBP1分布在魁蚶全部正常器官中;脂多糖刺激后,Sb-BPI/LBP1在体内含量明显增多,证实Sb-BPI/LBP1参与了宿主免疫防御,抵制革兰阴性菌的侵袭此外,李伟等通过缓冲液抽提硫酸铵沉淀和柱层析技术别离得到了相对分子量为76.2 kDa的魁蚶防卫素经抗菌活性检测发现
11、,魁蚶防卫素对金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌产气杆菌变形杆菌均有较强抑制作用Zheng等构建了魁蚶转录组文库,利用RACE技术克隆鉴定了魁蚶铁蛋白SbFer,并异源叙述得到了重组SbFerRT-PCR检测发现,在鳗弧菌刺激后,SbFer在魁蚶体内叙述显著回升,表明SbFer作为一种免疫防御剂参与了宿主免疫防御ᥰ医药学论文活性蛋白魁蚶毛蚶泥蚶药理作用377;体外抑菌实验证实,SbFer对革兰阳性菌和革兰阴性菌均具有一定抑菌活性随后,Zheng等利用相似的办法鉴定出魁蚶中的锰超氧化物歧化酶SbMnSOD异源叙述得到重组SbMnSOD后体外抑菌实验发现,SbMnSOD同样参与了宿主免疫
12、防御,并对大肠杆菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌有一定抑菌作用除抗菌活性蛋白外,人们也从魁蚶中发现了抗肿瘤蛋白Xu等从魁蚶中别离纯化得到了一种相对分子量20538Da,富含谷氨酸/谷氨酰胺天冬氨酸/天冬酰胺和赖氨酸的抗肿瘤蛋白J2-C3J2-C3对3种人源肿瘤细胞A549HepG2和HT-29均有显著的抑杀作用,对人源肺癌细胞A549活性最好,IC 50为65.57g/mL;其次是人源肝癌细胞HepG2和人源直肠癌细胞HT-29,其IC 50分别为93.33和122.95g/mL此外,Jung等从魁蚶中别离得到一种抗凝血蛋白体外抗凝血实验证实,该抗凝血蛋白可以延长活化局部凝血酶时间(APTT),通
13、过抑制凝血级联系统上的IX因子而非分解纤维蛋白发挥抗凝血作用Shibata等从魁蚶中别离得到一种39kDa的天冬氨酸消旋酶,此酶可将L型天冬氨酸转变为D型1.3泥蚶活性蛋白成分最早关于泥蚶活性蛋白成分的研究是泥蚶凝集素的发现凝集素是自然界广泛存在的糖蛋白或能和糖特异结合的蛋白,具有汇集血细胞的生物活性二十世纪九十年代,Dam运用亲和层析技术从泥蚶血浆中别离得到了3种血细胞凝集素AnadarinPAFL和Anadarin MSAnadarin P是一种相对分子量为130kDa的半乳糖特异性血细胞凝集素,其中2个亚基以非共价键的形式聚合而成,可使兔血细胞凝集当有半乳糖存在时,AnadarinP能够与D-半乳糖的C3C4的羟基进行特异性结合,从而抑制AnadarinP对血细胞的凝集AFL是一种少见的能与羟乙酰神经氨酸12
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