实验室HBVDNA定量检测的临床意义北京大学

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1、1博士，北京大学基础医学院病原生物学系副教授博士，北京大学基础医学院病原生物学系副教授，硕士研究生导师，硕士研究生导师 SCI期刊Journal of Gastroenterology and Hepatology、Archives of Virology和Immunological Investigations和中国病毒病杂志、中华微生物学和免疫学的长期审稿人 主要研究课题主要研究课题 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项“十二五十二五”课题课题“乙型和丙型病毒性乙型和丙型病毒性肝炎诊断及临床监测的研究肝炎诊断及临床监测的研究”子课题子

2、课题“新研制及优化试剂的质量评价新研制及优化试剂的质量评价”（批准号：2012ZX10002005-004）；科技部科技部863课题课题“高灵敏检测试剂及基于基因组的诊疗技术高灵敏检测试剂及基于基因组的诊疗技术”（批准号：2012AA022605）“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项科技重大专项“十一五十一五”课题课题“丙型肝炎的临丙型肝炎的临床转归及难治性丙肝的机制和治疗方案优化床转归及难治性丙肝的机制和治疗方案优化”（批准号：2008ZX10002-013）。国家自然科学基金面上项目国家自然科学基金面上项目“HCV慢性感染者和病毒自发清除者外

3、周血单核细胞介导的固慢性感染者和病毒自发清除者外周血单核细胞介导的固有免疫应答特征研究有免疫应答特征研究”（批准号：（批准号：81271826）。）。沈 弢北京大学 病原生物学系2013-06-022核心电子器件、高端通用芯片及基础软件新产品核心电子器件、高端通用芯片及基础软件新产品极大规模集成电路制造装备与成套工艺极大规模集成电路制造装备与成套工艺新一代宽带无线移动通信网新一代宽带无线移动通信网高档数控机床与基础制造装备高档数控机床与基础制造装备大型油气田及煤层气开发大型油气田及煤层气开发大型先进压水堆及高温气冷堆核电站大型先进压水堆及高温气冷堆核电站水体污染控制与治理水体污染控制与治理转基

4、因生物新品种培育转基因生物新品种培育重大新药创制重大新药创制艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治大型飞机大型飞机高分辨率对地观测系统高分辨率对地观测系统载人航天与探月工程载人航天与探月工程表1、国家中长期科技发展规划纲要（20062020年）确定的重大科技专项Hepatology,2009J Hepatol,201220122012：为了避免乙肝复发，：为了避免乙肝复发，HBV DNAHBV DNA需控制在实时荧光需控制在实时荧光PCRPCR检测不检测不到的水平（到的水平（10-15IU/ml10-15IU/ml）。）。HBV DNAHBV DNA的监测是检测治

5、疗失败的关的监测是检测治疗失败的关键。键。20092009：目前，：目前，HBV DNAHBV DNA实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的灵敏度以达到的灵敏度以达到5-10IU/ml5-10IU/ml，检测上限以达到检测上限以达到8-9log108-9log10，用高灵敏度的定量检测试剂准确检测血，用高灵敏度的定量检测试剂准确检测血清清HBV-DNAHBV-DNA是乙肝抗病毒治疗过程中疗效观察和治疗终点判定的关键是乙肝抗病毒治疗过程中疗效观察和治疗终点判定的关键因素。因素。国际指南对国际指南对HBV DNA检测的要求检测的要求我国曾是世界上我国曾是世界上HBVHBV感染流行最高的地区之一感染

6、流行最高的地区之一WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:Hepatitis B1/49300万万 慢性慢性HBV感染者感染者1/32千万千万3千万千万 慢性乙肝患者慢性乙肝患者1/230万万肝癌患者肝癌患者全国全国13亿人口，亿人口，5-6亿曾感染亿曾感染HBV,占全国总人口近占全国总人口近40%159岁人群血清岁人群血清HBsAg流行率流行率 7.18%(2006)1.FM Lu,et al.J.of Viral Hepatitis 20092.FM Lu&H Zhuang.Chiness J.of Medicine3.X.Liang,et al.J.of Infectious Di

7、sease,20094.X.Liang,et al.Vaccine,2009（一）慢性乙型肝炎（二）乙型肝炎肝硬化（三）携带者（四）隐匿性慢性乙型肝炎 慢性乙型肝炎临床诊断类型慢性乙型肝炎临床诊断类型 临床诊断临床症状、疾病史实验室诊断生化学检查HBV血清学检测（抗原/抗体系统）HBV DNA（基因型、亚型和变异检测）病理学诊断影像学诊断 慢性HBV感染临床诊断HBV携带携带者者(HBV DNA+)携带者携带者慢性乙肝慢性乙肝HBeAg-慢乙肝慢乙肝乙肝乙肝肝硬化肝硬化乙肝相关乙肝相关肝癌肝癌隐匿性慢性隐匿性慢性乙肝乙肝非活动性非活动性HBsAg携带携带者者(HBV DNA)轻、中、重轻、中、

8、重活动期和静活动期和静止期止期代偿期代偿期失代偿期失代偿期HBeAg+慢乙肝慢乙肝医药科技的进步已经使慢性乙型肝炎已医药科技的进步已经使慢性乙型肝炎已成为可以治疗的慢性疾病成为可以治疗的慢性疾病2005年我国制定了第一部年我国制定了第一部慢性乙型病毒性肝炎防治指南慢性乙型病毒性肝炎防治指南规范的抗病毒治疗可以有规范的抗病毒治疗可以有效地阻断或减缓疾病进展、效地阻断或减缓疾病进展、减少终末期肝病的发生减少终末期肝病的发生免疫耐受期免疫耐受期 HBeAg+HBeAg-/anti-HBe+(preC/core promoter mutants)HBV DNA 2000 IU/mL 2 x 107 I

9、U/mL 2 x 104 IU/mL(HBeAg+CHB)(Inactive-carrier state)(HBeAg-CHB)ALTNormal/minimal change/mild CHModerate/severe CHModerate/severe CHNormal/mild CH moderate fibrosisCirrhosisCirrhosisInactive cirrhosis2-6%/yr8-10%/yr20-30%Modified from Lok et al.Hepatology 2007;45:507-539Pungpapong et al.Mayo Clin Pr

10、oc 2007;82:967-975.免疫清除期免疫清除期（免疫活动期）（免疫活动期）免疫控制期免疫控制期(低病毒复制期低病毒复制期)再活动期再活动期侯金林教授惠许侯金林教授惠许抗病毒抗病毒治疗治疗抗病毒抗病毒治疗治疗临床治疗的进步对实验室临床治疗的进步对实验室检测提出了新的要求检测提出了新的要求慢性慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标感染分期及相关实验室检测指标 鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009 慢性乙型肝炎的诊断开展抗病毒治疗的重要指标：HBeAg阳性慢乙肝患者阳性慢乙肝患者：HBV DNA 20 000 IU/mL，伴，伴有肝脏损伤者有肝脏损伤者(ALT升高，或肝活检

11、发现肝脏炎症升高，或肝活检发现肝脏炎症)；HBeAg阴性慢乙肝患者阴性慢乙肝患者：HBV DNA 2 000 IU/mL伴有肝伴有肝脏损伤指标，即应开始抗病毒治疗。脏损伤指标，即应开始抗病毒治疗。代偿期肝硬化患者：代偿期肝硬化患者：HBV DNA+HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标判断抗病毒治疗疗效（RGT）以以治疗治疗24周时血清周时血清HBV DNA绝对水平判断：绝对水平判断：完全病毒学应答：低于60 IU/mL 部分应答：低于2 000 IU/mL应答不充分：60 IU/mL 2 000 IU/mL 例如：HBV DNA载

12、量检测在治疗优化路线图中的作用例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标在多个国家和地区的慢乙肝防治指南，均把用灵敏的PCR检测方法检测不到HBV DNA作为停药的重要指证。Domestic AA m p l l c o r MonltorCobas TaqManRealArt HBV LC PCR(ArtusBiotech)Abbot Real-timeHBV(Abbott)Versant HBV DNA 1.0(kPCR,Siemens)10102103104105106107108109(IU/mL)HBV DNA定量检测试剂及

13、其检测灵敏度和线性范围定量检测试剂及其检测灵敏度和线性范围 Domestic B以上数据来源：各企业试剂说明书国产乙肝病毒国产乙肝病毒DNA定量试剂在检定量试剂在检测方法上与进口试剂存在明显差别测方法上与进口试剂存在明显差别原因分析原因分析一步法煮沸释一步法煮沸释放放HBV DNA+定量扩增定量扩增自动化提取制自动化提取制备备HBV DNA+扩增检测扩增检测VS1ul国产试剂的实际用于检测的血清量仅为国产试剂的实际用于检测的血清量仅为1 ul200ul国内现有核酸检测技术流程PCRPCR体系配置体系配置核酸提取核酸提取荧光荧光PCRPCR仪器操作仪器操作PCRPCR体系配置，核酸提取，荧光体系

14、配置，核酸提取，荧光PCRPCR检测。检测。一站式全自动检测！一站式全自动检测！国外的全自动核酸检测仪器国产乙肝病毒DNA定量试剂质量的提高需向系统（试剂+体系）转换对策1：技术进步，全自动的核酸提取设 备+基于开放设备的定量试剂 对策2：通过行政手段淘汰劣质试剂；对策3：由维价格论综合考虑质量与价格我们已经完成配合自动化仪器的磁珠核酸提取试剂，达到国外先进我们已经完成配合自动化仪器的磁珠核酸提取试剂，达到国外先进水平。水平。圣湘公司磁珠法提取效果圣湘公司磁珠法提取效果国外著名国外著名C公司提取效果公司提取效果圣湘公司自主研发的核酸提取试剂（磁珠法），实现了DNA/RNA共提取。效果等效于国外

15、著名同类试剂。HBV灵敏度可达10IU/ml，HCV灵敏度达20IU/ml。10IU/ml磁珠核酸提取试剂可在各种不同仪器上进行下游检测磁珠核酸提取试剂可在各种不同仪器上进行下游检测301.定量检测定量检测HBV感染者血浆感染者血浆(清清)HBV DNA是了解肝内是了解肝内HBV复制水平复制水平的可靠指标，也是的可靠指标，也是HBV感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标。感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标。2.近年，国产试剂的质量得到很大改进，但多数试剂的灵敏度、准确性近年，国产试剂的质量得到很大改进，但多数试剂的灵敏度、准确性及重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距。尤其对低病毒载及

16、重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距。尤其对低病毒载量或存在干扰物质的临床标本进行检测时，差距更为明显。量或存在干扰物质的临床标本进行检测时，差距更为明显。3.目前我国市场上主流的国产目前我国市场上主流的国产HBV DNA定量试剂盒多是基于即将废除定量试剂盒多是基于即将废除的煮沸法核酸提取方法，检测下限一般为的煮沸法核酸提取方法，检测下限一般为5001000 IU/ml，不能，不能满足临床诊断的需求。满足临床诊断的需求。4.在国家在国家“十二十二.五五”传染病防治重大专项传染病防治重大专项“乙型病毒性肝炎临床诊断及乙型病毒性肝炎临床诊断及监测技术的研究监测技术的研究”的支持下，基于磁珠法

17、核酸提取的国产的支持下，基于磁珠法核酸提取的国产HBV DNA定量试剂盒已成为主流研发方向。定量试剂盒已成为主流研发方向。31对国产湖南圣湘乙型肝炎病毒核酸定量检测（对国产湖南圣湘乙型肝炎病毒核酸定量检测（PCR-荧荧光探针法）试剂盒的可溯源性、准确度、精密度和临光探针法）试剂盒的可溯源性、准确度、精密度和临床应用进行质量考评。床应用进行质量考评。321.用基于磁珠法自动化核酸提取平台的该国产用基于磁珠法自动化核酸提取平台的该国产HBV DNA定量试剂定量试剂盒和罗氏盒和罗氏HBV DNA定量试剂盒对定量试剂盒对WHO的的 HBV DNA系列稀释系列稀释标准品标准品(50、200、2000、2

18、0 000 IU/ml)进行溯源性分析，进行溯源性分析，确定试剂盒检测的可靠性。确定试剂盒检测的可靠性。2.用这用这2种试剂盒对种试剂盒对HBV B和和C基因型标准血浆基因型标准血浆(分别稀释为分别稀释为25、50、200、2 000、20 000、200 000 IU/ml)分别在三个分别在三个不同检测中心共进行不同检测中心共进行216次平行检测，比较其准确度和精密度。次平行检测，比较其准确度和精密度。3.用用2种方法平行检测种方法平行检测5份份HBV DNA阴性血浆样本和阴性血浆样本和37份不同病份不同病毒载量的毒载量的HBV DNA阳性临床血浆标本，并评价其相关性和符合阳性临床血浆标本，

19、并评价其相关性和符合率。率。3334罗氏罗氏 COBAS罗氏罗氏 COBAS Version 2.0雅培雅培 RealtimeHBV DNA湖南圣湘湖南圣湘新型新型HBV DNA kit样本用量样本用量850l 500l 200l 或或 500l 200l 核酸提取方法核酸提取方法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法检测下限检测下限(LOD)12 IU/mL(EDTA 血浆血浆)9 IU/mL(EDTA 血浆血浆)或或 19 IU/mL(血清血清)10 IU/mL 或或 15 IU/mL

20、(EDTA/ACD血浆、血浆、血清血清)10 IU/mL(血清血清)线性范围线性范围54.5-1.1108 IU/mL20-1.7108 IU/mL10-1.0109 IU/mL(500l)15-1.0109 IU/mL(200l)20-2.0109 IU/mL临床特异性临床特异性100%100%99.5%100%适用基因型适用基因型基因型基因型 A-G基因型基因型A-H,包括包括 pre-core 突变突变基因型基因型A-H基因型基因型A-H储存条件储存条件2-8 2-8-20 or colder核酸提取试剂核酸提取试剂2-8；扩增反应试剂扩增反应试剂-205。有效期有效期18 个月个月25

21、 个月个月12个月个月9 个月个月35Roche COBASRoche COBAS 2.0湖南圣湘滴定度结果滴定度结果报告结果报告结果Not detectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上或没有得到HBV的Ct值。报告“没有检测到HBV DNA”。12 IU/mL检测到HBV DNA，低于12 IU/mL。12 IU/mL 和1.10E+08 IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果滴定度结果报告结果报告结果Not detectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上或没有得到HBV的Ct值。报告“没有检测到HBV DNA”。1.70E+08 IU

22、/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果滴定度结果报告结果报告结果10 IU/mLHBV DNA含量低于试剂盒检测下限。10 IU/mL 和2.0E+09 IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果滴定度结果报告结果报告结果Not detected未检测到目标(Target not detected)10 IU/mL(500l样本量)1.0E+09 IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。ABBOTT kit36Principal Investigator(负责人）负责人）Site（地点）（

23、地点）Reproducibility(可重复性检测）可重复性检测）Traceability（对（对WHO标准品的标准品的可可溯源性分析）溯源性分析）鲁凤民鲁凤民北京大学医学部微生物系北京大学医学部微生物系谭德明谭德明长沙湘雅医院传染病科长沙湘雅医院传染病科陈德喜陈德喜首都医科大学附属佑安医院首都医科大学附属佑安医院37l购买获得购买获得WHO HBV-DNA 标准物质，用于评价不同公司标准物质，用于评价不同公司HBV-DNA定量检测方法的可溯源性（定量检测方法的可溯源性（traceability）。）。lHBV标准品将用标准品将用HBV阴性阴性EDTA抗凝血浆进行稀释。稀释浓度初步设抗凝血浆进

24、行稀释。稀释浓度初步设定为定为50、200、2,000/20,000 IU/mL四个临床治疗关键的节点四个临床治疗关键的节点浓度值。浓度值。l每天每种仪器检测上述稀释浓度样本一个反应（含对照管）。共检测每天每种仪器检测上述稀释浓度样本一个反应（含对照管）。共检测三天（即每种浓度检测三天（即每种浓度检测3次）。次）。l以上检测均在北京大学医学部微生物系进行。以上检测均在北京大学医学部微生物系进行。38WHO genotype A2 PanelRoche COBAS 2.0SansureRep 1Rep 2Rep 3Rep 1Rep 2Rep 3Day 1:Day 2:repeat the abo

25、ve testing patternDay 3:repeat the above testing patternNIBSC：英国国家生物标准与检定所：英国国家生物标准与检定所39试剂试剂理论值理论值(IU/ml)理论值理论值(lg IU/ml)实测值实测值(lg IU/ml)相对偏差相对偏差(lg IU/ml)标准差标准差(lg IU/ml)圣湘圣湘(PCR-荧光探针荧光探针法法)501.6991.524-0.1760.2072002.3012.119-0.1820.20520003.3013.126-0.1750.09520 0004.3014.145-0.1560.103罗氏罗氏(COBA

26、S 2.0)501.6991.579-0.1210.0292002.3012.056-0.2450.0922 0003.3013.030-0.2710.13120 0004.3014.135-0.1660.20240l由第三方提供高浓度的HBV B&C亚型标准血浆。血浆HBV病毒载量须大于1,000,000。l以上血浆用HBV阴性EDTA抗凝血浆进行稀释。稀释浓度设定6个评价节点：25、50、200、2,000、20,000、200,000 IU/mL。l每天每种仪器检测上述稀释浓度样本一个反应（含对照管）。共检测三天（即每种浓度检测3次）。l准确度判断标准为所有检测节点上的的相对偏差 均在0

27、.3 lg IU/ml之内为可接受范围。精确度判定依据对同一检测节点平行检测9次后的变异系数，变异系数越小意味精确度越高。l以上检测将在北京大学医学部微生物系、首都医科大学附属佑安医院、湖南湘雅医院传染病科三地多中心同时进行。HBV B基因型标准血浆：卫生部国家临检中心惠赠，编号基因型标准血浆：卫生部国家临检中心惠赠，编号GBW09150，浓度为，浓度为1.2106 IU/ml。HBV C基因型标准血浆：中国药品生物制品检定所惠赠。浓度为基因型标准血浆：中国药品生物制品检定所惠赠。浓度为2108 IU/ml。41Day 1:Day 2:repeat the above testing patt

28、ernRep 1Rep 2Rep 3Rep 1Rep 2Rep 3SansureGenotype BPanelRocheRep 1Rep 2Rep 3Rep 1Rep 2Rep 3SansureGenotype CPanelRocheDay 3:repeat the above testing pattern42HBV 基因型评价试剂理论值(IU/ml)理论值(lg IU/ml)检测次数实测值(lg IU/ml)实测值(IU/ml)相对偏差(lg IU/ml)方差（标准差）(lg IU/ml)LognormalCV%HBV B型湖南圣湘试剂(PCR-荧光探针法)251.39891.36223.

29、7-0.0360.013(0.114)8.38501.69991.70452.50.0050.017(0.130)7.612002.30192.3412260.040.012(0.110)4.7420003.30193.36123500.060.009(0.097)2.70 20 0004.30194.34222 6000.0410.012(0.108)2.49 200 0005.30195.328216 0000.0270.006(0.079)1.49 罗氏试剂(COBAS 2.0)251.39891.64246.90.2440.027(0.167)10.17501.69991.94588.

30、70.2460.003(0.054)2.802002.30192.4913170.190.011(0.106)4.2720003.30193.51833200.2170.003(0.056)1.5920 0004.30194.581384000.280.003(0.059)1.28200 0005.30195.3982510000.0970.002(0.048)0.89251.39891.32522.8-0.0730.027(0.166)12.520.025(0.157)43l国产新型试剂盒的检测结果较稳定，相对偏差均在0.1lg IU/mL范围内。l罗氏试剂盒的检测结果尽管均在可接受范围内，

31、但针对B基因型标准血清，相对偏差基本位于0.20.3 lg IU/ml。44l2种试剂盒之间精密度的差异无统计学意义。45l2种试剂盒对HBV DNA低载量血浆样本检测的变异系数均显著高于高载量血浆(B基因型：P=0.0031；C基因型：P=0.0005)。46临床血清盘：临床血清盘：共共42份份,含含5份份HBV DNA阴性阴性(HBsAg和抗和抗-HBc阴性阴性)和和37份份HBV DNA阳性阳性(Abbott RealTime HBV Test试剂盒检测判定试剂盒检测判定)不同滴度水平的血浆样不同滴度水平的血浆样本。分别用本。分别用Roche、圣湘、圣湘HBV核酸定量试剂盒检测，比较三者

32、之间的符合率和核酸定量试剂盒检测，比较三者之间的符合率和特异性。特异性。湖南圣湘和罗氏HBV DNA定量试剂盒对42份临床血清盘测定结果的比较分析罗氏罗氏 HBV DNA定量定量试剂试剂（份（份）湖南圣湘湖南圣湘HBV DNA定量试剂定量试剂(份份)阳性阳性阴性阴性阳性阳性370阴性阴性14合计合计384总符合率：97.62%47对37份阳性样本两种检测试剂的检测结果为显著相关48l临床血清盘中有2个样本（编号236和283）Roche HBV试剂反复检测为阳性，但是低于20 IU/ml。用圣湘磁珠法试剂反复检测结果均在10 IU/ml左右。l 我们在圣湘公司试剂检测靶基因区域之外，设计了套巢

33、式引物进行PCR扩增和克隆测序，同时严格设置阳性质控和阴性质控，把扩增产物送往测序公司进行克隆测序。l结果证实编号236和283两个样本的测序结果为HBV基因组序列，测序长度为258bp，与理论序列长度一致。克隆测序结果与HBV AH基因型标准序列进行进化树分析，证明均为C基因型，但分属于2个不同的亚簇。49l湖南圣湘研发的国产新型试剂盒与罗氏试剂盒在溯源性、准确度、精湖南圣湘研发的国产新型试剂盒与罗氏试剂盒在溯源性、准确度、精密度等指标上无明显差异。密度等指标上无明显差异。l由于未能收集足够数量超高病毒载量的临床标本由于未能收集足够数量超高病毒载量的临床标本(2.0108 IU/ml)，本研究未能对该，本研究未能对该2种试剂盒的线性范围进行严格的评价。种试剂盒的线性范围进行严格的评价。l新型国产试剂盒在保存温度及时间方面尚有待改进新型国产试剂盒在保存温度及时间方面尚有待改进 罗氏试剂盒为罗氏试剂盒为28，25个月；国产试剂盒为（个月；国产试剂盒为（-205），9个月）个月）。l新型国产试剂在低病毒载量检测的稳定性仍有提高空间。新型国产试剂在低病毒载量检测的稳定性仍有提高空间。50谢谢 谢谢!