实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定

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1、实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定一、实验目的和要求1) 设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。2) 设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。3) 了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。4) 掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。5) 学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。二、器材和试剂1实验器材：层析系统LH-2,(包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器) 6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml,各16个；移液管1、2、5ml,各16个； 量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器4个；滴管，16个；滤

2、纸卩120,1盒；2实验试剂：(1)丙酮； (2)1， pHl.15 的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入23 总体 积的蒸馏水溶解，用6mol / L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h,然后在pH计上校正至 pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol/L,pH6.5,磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol/L 氯化钠一0.5mol /L氢氧化钠溶液；(5)0. 5mol /L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠一0.02mol /L磷酸盐缓冲液，pH6.5； (7)底物缓冲液：0.05mol/L, Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含 2.22mol / L的氯化

3、钙；(8)2mmol / 1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；lmg / mL胰蛋白酶 溶液：用 0.001 mol/L 盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32) ； (11)SphadexG-25； (12) 鸡蛋 30 个；(13) 1硝酸银三、实验原理1. 蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、 G2、 G3 球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白2. 鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid, CH0M)的性质：鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid, CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋

4、白，可强烈地抑 制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作 用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。也可将其制成 亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。鸡卵类黏蛋白至今还未能获得单一组分的制品，目前至少已获得4 种不同组分，它们在 抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上差别不大，但是在糖基部分（主要为D-甘露糖、D-半 乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量有差别。由于Ovomucoid所带的糖基不同，电泳行为呈现 出不均一性，其pI大致在3.9-4.5,相对分子质量28 000，卵类黏蛋白抑制胰蛋白酶的摩 尔比为 1：1。

5、卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都相当稳定，而在碱性溶液中不稳 定，尤其是当温度较高时会迅速失活。Ovomucoid带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在 50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的pH，丙酮浓度 和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白o Ovomucoid在280nm处的百分 消光系数A1% . = 4.13,即蛋白酶浓度为lmg/ml时,溶液的吸光度A = 0.413，据此可1cm 280280以测定其溶液中蛋白质的含量。本实验主要参照Kassell的方法，鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）丙酮溶液处理，除去沉淀 物，然后经丙酮

6、分级沉淀获得粗晶，再用DEAE-纤维素柱层析纯化而得合格产品。四、实验步骤1鸡卵类黏蛋的提取取50mL鸡卵清，加入等体积的10%, pH1.15三氯乙酸溶液（缓缓加入以防局部过酸出 现块状物），形成类似于酸奶状的白色沉淀，轻轻地搅拌均匀。在酸度计上检查最终pH值应 为大约3.5，若pH值偏离3.50. 2则要用5mol / L氢氢化钠或5mol/L盐酸调节pH值， 由于提取液非常稠，在调节pH值时防止局部过酸或过碱。pH值调好稳定后，在室温下静置 4h以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r / min离心10min。弃去沉淀物，上清液用滤 纸过滤，以除去上清液中脂类物质及其他不溶物。收集滤

7、液转入500mL的烧杯内。检查滤液 的pH值是否为3.5,否则要调回到pH3.5o置冰浴或冰箱内冷却片刻，缓慢加入3倍体积预 冷的丙酮，用玻璃棒轻轻搅匀，用塑料薄膜盖好封严，在冰浴里放置24h，待鸡卵类黏蛋 白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部转移到50mL带盖的离心杯里， 加盖经平衡后以3000r / min离心15min，除去上清，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去 残留丙酮。使沉淀物由白转变为透明黏稠物后停止抽气。加入20mL蒸馏水溶解，若溶解液 混浊则用滤纸滤去不溶物。滤液经SephadexG-25柱层析法脱盐或者经透析除盐。2.鸡卵类黏蛋的脱盐用 SephadexG-2

8、5 柱层析法脱盐的操作如下：称取30gSephadexG-25，用500mL0.02mol / L，pH6.5的磷酸盐缓冲液在100C热溶胀2h或者室温下溶胀24h。脱气后装柱(35mmx300mm),柱床体积约150mL。用约2倍体积的0.02molL， pH6.5 磷酸盐缓冲液平衡。流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经 紫外分光光度计测定光吸收，其A小于0.02即可上样。280取20mL鸡卵类黏蛋白提取液上柱(上样量不超过柱床体积的1 / 6)。用同样的缓冲液洗 脱，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后盐才开始流出，盐通常在280nm无明显光吸收，若绘 出第二峰则是残留丙酮峰。丙酮和盐同

9、时流出。洗脱曲线见下图。3心鸡卵类黏蛋白的纯化贵白r/mL円1 曙卵技轧击门丁.闵怙:以，汕朴二扩脱盐俛脱曲线洗脱Ml*为0.02碑酸盐貌冲液出2 讷聊粪牡也止氐E纤维嵐*汀一的洗脱曲线平齒臧：0.02 mol/L, pH6.5 WBft盐冲缓戒*洗脫fflh 0.3 mol/L NaCi-0.02mol/L. pH6,5通过上述方法获得的鸡卵类黏蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等电点不同， 采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。称取10g DEAE-纤维素粉(DE-32)，用150mL 0.5 mol / L氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶 液浸泡20min。用布氏漏斗(内

10、垫为200目尼龙网)抽滤。用蒸馏水洗至pH8. 0左右，抽干。 然后移至500mL的烧杯内，用150mL0.5mol / L盐酸溶液浸泡20min，再转移到布氏漏斗内， 抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用150mL0.2mol / L, pH6.5磷酸盐缓 冲液浸泡约15min，经真空干燥器脱气后装柱。取一支层析柱(35mmx200mm)装入约1/4体积的0.02mol / L，pH6.5磷酸盐缓冲液，将 处理过的DEAE-纤维素装入柱内。以同一缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳 定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，待A值小于0.02即可加样。280将经Seph

11、adexG-25脱盐后的鸡卵类黏蛋白溶液上柱吸附。以0.02mol / L,，pH6. 5的 磷酸盐缓冲液平衡，基线稳定后，改用0.3mol / L氯化钠0.2mol / L, pH6.5的磷酸盐缓冲 液洗脱，收集第二洗脱峰。柱层析图谱见上图。在鸡卵类黏蛋白液中所含的鸡卵清清蛋白， 在洗脱时可能出现一个小峰或不明显的峰形。在这种情况下可根据峰形大小，测定活性来确 定鸡卵类黏蛋白洗脱峰的位置。4.鸡卵类黏蛋白纯品的制备经DEAE-纤维素离子交换柱层析制得的鸡卵类黏蛋白溶液装入透析袋内，用蒸馏水进行 透析，间隔一段时间更换一次蒸馏水，直至经1硝酸银检查无氯离子为止。将透析过的鸡 卵类黏蛋白溶液转移

12、到烧杯内，小心地用1mol / L盐酸调节至pH4.0,取出lmL,稀释5 10 倍测定鸡卵类黏蛋白的含量及活性。然后加入 3 倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封严烧 杯口，在冰浴里静置4h左右。待鸡卵类黏蛋白完全析出后，倾去上清，沉淀转移到一个带 盖的50mL离心杯内，于3000r / min离心15min,弃上清，沉淀物放人真空干燥器内干燥， 即可得到透明胶状物一-鸡卵类黏蛋白（约200300mg）。5鸡卵类黏蛋白的含量测定配成一定浓度的鸡卵类黏蛋白溶液，测定A。鸡卵类黏蛋白的消光系数是:A1% =4.13。2801cm鸡卵类黏蛋白（mg/ mL） = （A X稀释倍数）/0.4132806.

13、鸡卵类黏蛋白的活性测定（选做）鸡卵类黏蛋白的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力单位表示。即：抑制 1 个胰蛋白酶活力 单位（BAEE单位）所需卵类黏蛋白量定为抑制剂的1个活力单位。取2个石英比色池（带盖，光程为l cm），一个加入0.05mol / L，pH8. 0 Tris-HCl缓 冲液和2. 0mol / L，BAEE底物溶液各1.5mL混匀，在波长253nm处调整仪器零点。另一个 比色池内加0.05mol / L，pH8.0, Tris-HCl缓冲液1.5mL，10p L胰蛋白酶液（约10p g胰蛋 白酶），10p L鸡卵类黏蛋白（约5-10p g鸡卵类黏蛋白）轻轻摇匀，在室温下（最好是在2

14、5C 恒温箱内）放置 2min.如蛋白酶与鸡卵类黏蛋白充分结合。然后加入2mol / L BAEE底物溶液1. 5mL,立即混 匀并记时。于波长253mn处测定其光吸收递增值 A /min。每隔30 s读数一次，使 A253253/ min值控制在0.05左右为宜，否则要根据/ min的大小适当减少或增加鸡卵类黏蛋白的量。以反应时间t为横坐标，A为纵坐标作图，取直线部分的任一时间间隔与相应的光吸 253收变化值为 A253 / min用A2表示。与此同时，以同样的方法（不加鸡卵类黏蛋白：测胰蛋白 酶的活性。通过作图得到光吸收变化值 A253 / min,用表示。鸡卵类黏蛋白的抑制活性及抑制比活

15、性的计算公式如下：鸡卵类黏蛋白的抑制活性单位(BAEE) = (A-A2)/0.001鸡卵类黏蛋白抑制比活单位(BAEE单位/mg胰蛋白酶) = (Al-A2) X1000/(Al-A2)/lX0001 式中A/胰蛋白酶 A253 / min； Aj加入抑制剂后胰蛋白酶/ min； I：测定时所用鸡卵类黏蛋白的量(p g); 1000：将抑制剂的微克数转换成毫、克数； 0.001：指吸光度每增加0.001定义为1个BAEE单位。五、注意事项1加入丙酮沉淀在冰浴中保持4 小时，注意保持冰浴状态。2层析柱下端过滤网孔径应与凝胶溶胀直径相匹配，防止漏胶或上下端压力差过大造成上 端出水。六、思考题1. 纯化蛋白质时如何选择离子交换树脂？2. 如何选择离子交换条件？3. 离子交换剂如何进行再生？4. 如何对基线进行调零？