泛素融合对EB病毒核抗原IDNA免疫效果的影响.ppt

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1、1 泛素融合对 EB病毒核抗原 1DNA免疫效果的影响 硕士生：王卫东 导 师：桑建利 教 授 谷淑燕 研究员 北京师范大学生命科学学院 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 2004年 6月 2 研究背景 选题目的、意义 （ Why） （ How） 课题设计 （ What） 实验结果 结论 3 研 究 背 景 EB病毒概述 EBNA1 蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与 MHC-I类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略 4 EB病毒（ 1） Epstain-Barr病毒（ EBV， HHV4）是一种 广泛感染人类的疱疹病毒。幼年时期的 EBV 原发感染一般不表

2、现出临床症状，但感染状 态终生持续。 90%以上的成年人终生携带该 病毒。 5 EB病毒（ 2） 口腔传播为主要途径 器官移植和输血 传播途径 裂解性感染 口腔鳞状上皮细胞 B 淋巴细胞 潜伏性感染 B 淋巴细胞 感染形式 EBV也是一种最具有转化能力的 病毒。到目前为止，已发现 EBV 与多种临床疾病密切相关，其中 包括多种恶性肿瘤 6 EB病毒相关疾病 疾病种类 疾病说明 1.原发感染 (a)急性 IM (b)慢性 IM (c)致死性 IM 2. 免疫抑制 患者的 B淋 (a) 器官移植患者 巴细胞瘤 (b) AIDS患者 3. Burkitts淋巴瘤 (BL) 4. 鼻咽癌 (NPC)

3、5. 何杰金病 (HD) 6. 胃癌 通常无疾病 症状 免疫功能失调后的延续性疾病 Ducan 综合症 -X连锁的淋巴细胞增生性紊乱 免疫系统抑制后的易发肿瘤 流行于非洲的赤道附近 流行于中国南方及东南亚， 80,000例 /年 50%的病例中有 EBV参与 7%的病例中有 EBV参与 7 EB病毒疫苗 预防性疫苗，阻断其原发感染来预防相关疾病 以 EBV的 MA（ gp350/220）为免疫原（其主要依据是 gp350/220能够诱导机体产生高滴度的中和抗体） 治疗性疫苗，清除体内 EBV感染的细胞 以 EBV的潜伏膜蛋白 LMP1和 LMP2为免疫原，进 行多肽、重组活疫苗、 DNA疫苗及

4、免疫细胞疫苗 等多种尝试 8 研 究 背 景 EB病毒及其相关疾病 EBNA1 蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与 MHC-I类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略 9 EBNA1是唯一一种在不同潜伏感染状态下均有表达的病毒蛋白 EB NA1 蛋 白 的 结 构 与 功 能 11 研 究 背 景 EB病毒及其相关疾病 EBNA1 蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与 MHC-I类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略 泛 素 蛋 白 酶 体 通 路 蛋白质抗原加工递呈的两条基本途径 14 研 究 背 景 EB病毒及其相关疾病 EBNA

5、1 蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与 MHC-I类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反 应中的作用 DNA疫苗的优化策略 15 16 CTL在机体免疫反应中作用 越来越多的证据表明 :细胞内感染和肿瘤的 保护性免疫并非主要依赖于中和抗体而是依赖于 细胞毒性细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) 的应答。细胞免疫尤其是 CD8+CTL细胞亚群在抗胞 内寄生菌、病毒、某些真菌感染及抗肿瘤免疫中 起着十分重要的作用。 17 CTL在 DNA疫苗免疫中的意义 能诱发强大 CTL反应的疫苗现已被公认为在 控制许多胞内病原的感染方面有着美好的前景。 DNA疫苗进入机体后，在宿主

6、细胞内合成靶 抗原，经加工后，由 MHC-I类途径递呈，可有效 激活机体产生 CD8+CTL。 18 研 究 背 景 EB病毒及其相关疾病 EBNA1 蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与 MHC-I类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略 DNA疫苗及其免疫机理 DNA疫苗优化策略 （高导入、高表达、高递呈） 21 泛素融合能增强 DNA疫苗的免疫效果 文献报道 Influenza virus (NP) LCMV (NP) HIV (Ref) EBV (LMP1) 可能机理 在细胞内表达的 泛素化靶抗原经蛋白酶体降解 后， 迅速被加工、处理和递呈，刺激机体 MHC

7、-I类分子限制的 特异 性 CD8+T淋巴细胞的增殖、分化 。 22 通过比较 Ubiquitin融合前后 EBNA1基因所诱发的 特 异 性体液免疫反应和 CTL反应的变化，分析 Ubiquitin的融合对 EBNA1的 DNA免疫效果的影响。 探索 EBNA1作为 EBV相关肿瘤的免疫治疗靶抗原的 可能性，为 EBV相关肿瘤治疗性疫苗的研究提供新 的思路。 进一步证实 Ubiquitin的融合对 DNA疫苗免疫效果的 增强效应。 选题的目的和意义 EBNA1基因扩增 课 题 设 计 ubiquitin基因扩增 ub-EBNA1基因融合 原核表达及纯化 真核表达质粒构建及表达分析 DNA免疫

8、 Balb/C小鼠 免疫效果评价 特异性 CTL检测 EBNA1特异性抗体检测 抗体制备 检测 抗 原 包 被 A B C D 24 第一部分 EBNA1与 Ub基因的扩增、融合 及序列测定 Balb/C小鼠肝细胞 Ub 基因 pBR322-K质粒 Ub-EBNA1 融合基因（测序） 总 RNA EBNA1基因 下游引物中引入了 Bgl II酶切位点，并将其 羧基端的第 76位氨基 酸由 Gly (GGC)突变 为 Ala (GCT) 根据 N末端法则将 N 末端第一个氨基酸由 Met（ ATG）突变为 Arg（ AGA），且引 入了 Bgl II酶切位点 PCR RT-PCR 连接 T载体

9、pMD18-EBNA1 pMD18-Ub 拼接 实 验 设 计 26 pM D18 -Ub -E BNA 1 质 粒 的 构 建 27 Ub基因的扩增 28 Ub基因的克隆及及鉴定 EBNA1基因的扩增、克隆及鉴定 30 pMD18-Ub-EBNA1质粒鉴定 31 小 结（ 1） 分别扩增了突变的 Ub和 EBNA1基 因。两者融合后（ Ub-Ala/Arg-EBNA1） 的基因测序分析表明：序列与预期结果 一致。 32 第二部分 EBNA1 的原核表达、蛋白纯化及抗体制备 实 验 设 计 构建原核表达质粒 pET30a-EBNA1和 pET30a-SS580 酶切鉴定 转化 BL21(DE3

10、)细菌 诱导表达分析 镍离子亲和柱纯化 免疫小鼠 采集血清 ELISA测定抗体滴度 Western blot检测 36 25-kDa EBNA1蛋白的表达与纯化 38 镍离子亲和柱纯化的 25-kDa EBNA1免疫 Balb/C小鼠后，制备了鼠抗 25-kDa EBNA1血 清，抗体滴度大于 1:6400。 图 25-kDa EBNA1蛋白的 western blot鉴定 A. SDS-PAGE分析 B. 鼠抗 25-kDa EBNA1血清 C. 鼻咽癌病人血清 1. 蛋白质分子量标准 2. 未诱导对照 3. 诱导后的表达 4. 纯化后的蛋白 1 2 3 4 B A 1 2 3 4 1 2

11、3 4 C kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 40 小 结（ 2） 诱导表达和纯化了 Mr 2.5 104左右的融合蛋白 （ 25-kDa EBNA1）。制备了鼠抗 25-kDa EBNA1血 清 。 免疫印迹显示，该蛋白能被鼻咽癌（ NPC）病 人血清和鼠抗 25-kDa EBNA1血清特异性识别。 41 第三部分 EBNA1和 Ub-EBNA1真核表达质粒的 构建及表达 分析 实 验 设 计 构建 pCI-EBNA1和 pCI-Ub-EBNA1真核表达

12、质粒 酶切鉴定 瞬时转染 HeLa细胞 表达分析 间接免疫荧光检测 Western blot检测 43 44 M 1 2 3 4 bp 2000 1000 750 500 250 100 Lane M. DL2000 1. pCI-EBNA1/Sma 2. pCI-EBNA1/Xba 3. pCI-EBNA1/EcoR 4. pCI / EcoR 图 pCI-EBNA1质粒酶切鉴定 Fig. Restriction endonuclease digestion map of plasmid pCI-EBNA1 M 1 2 3 4 5 bp 2000 1000 750 500 250 Lane

13、M. DL2000 1. pCI-Ub-EBNA1/ Sma 2. pCI-Ub-EBNA1/EcoR + Sal 3. pCI-Ub-EBNA1/Bgl 4. pCI-Ub-EBNA1/EcoR 5. pCI/EcoR 图 pCI-Ub-EBNA1质粒酶切鉴定 Fig. Restriction endonuclease digestion map of plasmid pCI-Ub-EBNA1 47 B 1 2 3 4 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 A A图 为 EBV阳性鼻咽癌病人血清免疫印迹结果 B图 为重组蛋白免疫小鼠之血清免疫印迹结果 1. pCI转染之 HeLa细

14、胞 2. pCI-EBNA1转染之 HeLa细胞 3. pCI-Ub-EBNA1转染之 HeLa细胞 4. 蛋白质分子量标准 图 真核表达蛋白的 Western印迹分析 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 1 2 3 4 48 小 结（ 3） 成功地构建了单基因和融合基因的真核表达质 粒。均能有效表达目的蛋白。 鼠抗 25-kDa EBNA1血清能够识别 HeLa细胞中 瞬时表达的全长 EBNA1蛋白。 49 第四部分 pCI-EBNA1和 pCI-Ub-EBNA1真核表达 载体的免疫效果评价 特异性抗体 水平测定 免疫动物 特异性 CTL 活性检测 体液免疫水平检测 细胞免疫水平

15、检测 实 验 设 计 51 52 图 DNA免疫小鼠的血清 EBNA1抗体滴度 Fig. Anti-EBNA1 antibody induced by DNA immunization in mice 0 50 100 150 200 3 6 9 weeks Antibody titer pCI pCI-EBNA1 pCI-Ub-EBNA1 53 CTL活性测定 免疫的小鼠 取脾，制备脾淋巴细胞 体外刺激 多肽负载的 P815细胞 丝裂霉素 C处理 刺激细胞 靶细胞 效应细胞 CTL测定 增 殖 杀伤 55 图 DNA免疫小鼠产生的 EBNA1特异性 CTL活性 Fig. EBNA1-spec

16、ific CTL responses induced by DNA immunization in mice 0 5 10 15 20 25 30 35 40 40:1 20:1 10:1 E:T Ratio % Specific lysis pCI-Ub-EBNA1 pCI-EBNA1 pCI 56 小 结（ 4） 单基因和融合基因免疫 Balb/C小鼠后能够诱生针 对 EBNA1 特异性的抗体和 CTL反应。二者诱生抗 体的效率无明显差别，但泛素的融合使得针对 EBNA1的特异性 CTL反应明显增强。 57 结 论（ 1） RT-PCR方法获得羧基端第 76位氨基酸由 Gly （ GGC）

17、突变 为 Ala （ GCT）的 Balb/C小鼠的 Ub基因， PCR 方法获得 N末 端第一个氨基酸由 Met （ ATG）突变为 Arg （ AGA）的 EBNA1基因。两者融合后（ Ub-Ala/Arg-EBNA1）的基因测 序分析表明：序列与预期结果一致。 将 EBNA1基因和 Ub-Ala/Arg-EBNA1融合基因分别克隆入 pCI 表达载体，成功地构建了真核表达质粒 pCI-EBNA1 和 pCI- Ub-EBNA1。瞬时转染 HeLa细胞后的结果显示，两种质粒 均能有效表达目的蛋白。 58 结 论（ 2） 质粒 pCI-EBNA1 和 pCI-Ub-EBNA1 免疫 Balb

18、/C小鼠后能够 诱生针对 EBNA1 特异性的抗体和特异性的 CTL反应。二者 诱生抗体的效率无明显差别，但泛素的融合使得针对 EBNA1的特异性 CTL反应明显增强。 构建了表达 EBNA1羧基端 190个氨基酸的原核表达质粒 pET30a-SS580，转化大肠杆菌 BL21（ DE3）后，诱导表达 了 Mr 2.5 104左右的融合蛋白（ 25-kDa EBNA1），免疫印 迹显示，该蛋白能被鼻咽癌（ NPC）病人血清特异性识别。 镍离子亲和柱纯化的 25-kDa EBNA1免疫 Balb/C小鼠后，制 备了鼠抗 25-kDa EBNA1血清，该血清能够识别 HeLa细胞中 瞬时表达的全长

19、 EBNA1蛋白。 59 致 谢 感谢我的导师桑建利教授和谷淑燕教授！ 感谢齐建国博士的具体指导！ 感谢细胞所和病毒病所的老师、同学！ 感谢家人的理解和支持！ 61 1、 Ub增强 EBNA1细胞免疫的分子机理的探讨。 2、调制细胞内 EBNA1的半衰期的方法探索。如： 酶 E3，药物 3、 25-kDa EBNA1蛋白及其抗血清的应用 展 望 62 讨 论（ 1） 63 讨 论（ 2） 64 A图 . 不同浓度 IPTG诱导表达的 SDS-PAGE分析 B图 . 相同浓度 IPTG（ 0.4mmol/L）诱导不同时间表达的 SDS-PAGE分析 A1, B1为未诱导对照 A10, B10 为

20、蛋白质分子量标准 A2 9泳道 IPTG浓度分别为 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mmol/L B2 9泳道诱导时间分别为 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 h 图 重组质粒 pET30a-SS580在 BL21(DE3)中表达的 SDS-PAGE分析 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B A 66 1. 诱导后的表达 2. 菌体破碎后上清 3. 穿柱液 4. 50mM

21、咪唑洗脱 5. 100mM咪唑洗脱 6. 150mM咪唑洗脱 7. 200mM咪唑洗脱 8. 300mM咪唑洗脱 9. 移除 Ni 离子 10. 蛋白质分子量标准 图 菌体破碎后上清纯化的 SDS-PAGE分析 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 67 1.未诱导对照 2. 诱导后的表达 3. 菌体破碎后沉淀 4. 2M尿素溶解 5. 4M尿素溶解 6. 6M尿素溶解 7. 8M尿素溶解 8. 未溶解沉淀 9. 蛋白质分子量标准 图 重组蛋白包涵体溶解的 SDS-PAGE分析 kDa 97.4 66.2 43.0 31.

22、0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20.1 68 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 1 2 3 4 5 6 20.1 14.4 69 70 71 72 Epstein-Barr virus (EBV), which may have co-evolved with Homo sapiens over millions of years, thus achieving a balance between viral persistence and immune control. Epstein和 Barr等于 1964年首先在非洲 Burkitt淋巴瘤 （ Burkitts lymphoma, BL）培养细胞中发现 人类是 EBV唯一的天然宿主 73 74 75 76