引物合成的详解

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1、引物合成的详解.txt这是一个禁忌相继崩溃的时代，没人拦得着你，只有你自己拦着自己， 你的禁忌越多成就就越少。自卑有多种档次，最高档次的自卑表现为吹嘘自己干什么都是天 才。11月 13日引物合成的详解1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法DNA合成仪有很多种，主要都是由ABI/PE公司 生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消 耗量的不同和单个循环用时的多少。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚 磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物 的3

2、端向5端合成的，相邻的核苷酸通过3Z5Z磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5 -羟基的保护基团DMT,获得游离的5 -羟基。第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷 酸活化中间体，它的 3端被活化， 5 -羟基仍然被 DMT 保护，与溶液中游离的 5 -羟基发 生缩合反应。第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5 -羟基没有参加反应（少于2%）, 用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更

3、稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5 -羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程 中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品 引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？ C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱, 但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短

4、的小片段。实际上， 它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克 隆的引物不能使用这个级别。 OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cart ridge柱中树脂间的亲合力作 用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的 纯化。 PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝 胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯 度大于95%，对长链Oligo DNA （大于50mer）的纯化特别有效。 HPLC纯

5、化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于 99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。3. 引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程 为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用 一定体积的水充分振荡溶解以后，用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。4. 需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定 订购引物的纯度级

6、别。应用 引物长度要求 纯度级别要求一般 PCR 扩增 45 base PAGE诊断 PCR 扩增 40base OPC, PAGEDNA 测序 20base 左右 OPC亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE， HPLC基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE反义核酸 根据实验要求定 PAGE修饰引物根据实验要求定 PAGE, HPLC5. 最长可以合成多长的引物？答：引物越长，出现问题的概率就越大。有的公司合成过120base的引物，产率很低。除非 需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长 （还不一定正确）引物的百分比

7、不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。6. 需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。 如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但 是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片 段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的 OD 数要求，其实也是对 社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总 觉得需要重复多次才能成功。7. 如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法

8、是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。 取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热 变性（95C,2mins）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进 行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下 没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色。8. 如何计算引物的浓度？ 答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul。 一般情况下， 建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）

9、按下列方式计算：V （微升）=OD 数*（乘） 33*（乘） *（乘） 20000 / （除） 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单 上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。注意： 1 OD260= 33 ug/ml.9. 如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4C （G + C）+ 2C （A + T）对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 （%GC） - 600/size公式中， Size

10、= 引物长度。Tm 的定义： Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand conce

11、ntration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10. 引物(含修饰)的分子量是如何确定的？答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要 估计一个引物的

12、分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的 平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +(Nx * Wx) +( Ni* Wi) +16* Ns- 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分 别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod, Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。 对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如 G+A 混合的分子量为 (3

13、13.21+329.21) /2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。常规碱基分子量：Base Molecular WeightA 313.21C 289.18G 329.21T 304.19I 314.2U 290.17常规修饰基团分子量修饰基团 分子量 修饰基团 分子量5-Biotin 405.45 3-TAMARA 623.605-(6 FAM) 537.46 3-Dabsyl 498.495-HEX744.133-(6 FAM) 569.465-TET675.243-Amino Modifier C3 153.075-Cy5533.633-Amino Modi

14、fier C7 209.185-Cy3507.593-Thiol Modifier C3 154.1211. 如何溶解引物？答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引 物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温 放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为 有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5)，引物在这种条件下不稳定。12. 如何保存引物？ 答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室 温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以

15、长期保存。如果对实验的重复性要求较高， 合成的 OD 数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。1 3.合成的引物5端是否有磷酸化答：合成的引物5为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5端磷酸 化，或者要求引物合成公司合成时直接在5或3端进行磷酸化，需要另外收费。14. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的 5磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引 物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善 引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火 温度

16、。15. 测序发现引物有突变是怎么回事？ 答：测序发现引物区域有突变，特别是 40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也 会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的， 碱基输错的机会不多。核酸合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种 突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一 样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合 成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是 99%，副产品不可以避免。引物序 列中插

17、入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失）MT, 导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是 带帽（capping）反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5 -羟基没有参加反应单 体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原 因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能 很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补 上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化 为烯醇异

18、构体 （脱嘌呤）， 2,6 diaminopurine , DNA 复制和扩增过程中 DNA 聚合酶将 2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌吟现象在富含嘌吟的引物中发 生的频率较高。脱嘌吟的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或 A 的缺失。引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率 建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。16. 长链引物为什么出错的几率非常高？ 答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素 客观条件都有

19、一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的 引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突 变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率， 比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成， 您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。17. 如果测序发现突变，该如何处理？ 答：遇到这种情况，首先和核酸合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，主要 是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成 序列没有输错的情况下，建议重

20、新挑取克隆测序，可能会找到正确克隆的。根据经验，40个 碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需 要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如 何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都 可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现 一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。18. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳， 上样量都是

21、非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带 回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象,PAGE纯化 的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少 OD 数，引物遇到的问题可能就会少一些。19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？ 答：下列原则供您参考。 TaqMan探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50T50bp),但不能与引物重叠。 长度一般为18-40mer。 G-C 含量控制在 40-80%左右。避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。在引物的 5端避免使用 G。选用比

22、较多的碱基C。退火温度Tm控制在68-70C左右。有用的荧光染料参数Name吸收波长发射波长 colors6-FAM ( 6-carboxy-fluorescein)494nm 518nm GreenTET ( 5-tetrachloro-fluorescein)521nm538nm OrangeHEX ( 5-hexachloro-fluorescein)535nm 553nm PinkTAMRA( tetramethyl-6-carboxyrhodamine)560nm582nm RoseROX ( 6-carboxy-x-rhodamine)587nm607nm RedCy3( Indo

23、dicarbocyanine)552nm 570nm RedCy5( Indodicarbocyanine)643nm 667nm Violet20. Primer 设计的基本原则是什么？ 答：引物设计的下列原则供您参考。引物长度一般在18-35mer。 G-C含量控制在40-60%左右。避免近 3端有酶切位点或发夹结构。如果可能避免在3端最后5个碱基有2个以上的G或C。如果可能避免在 3端最后 1 个碱基为 A。避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。退火温度Tm控制在58-60C左右。 如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。21. 为什么引物的0D260/0D

24、280小于1.5 ?答：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引 物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引 物的纯度。0D260/0D280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个 20mer同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成 密切相关。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base CompositionsBase Composition A260/2

25、805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.6622. 同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量（如质粒DNA）,因为EB可以嵌合到双链 DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程 度也会有差异，比如0ligo（dT）等不形成二级结构，EB染色效果就非

26、常差。所以不要用EB 染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。23. 引物不纯会有什么后果？答：引物不纯可能会导致：1）非特异性扩增；2）无法用预先设计在引物5端酶切位点的酶 切开，特别是没有保护碱基的引物； 3） 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新 纯化。24. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？答：如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混 合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用 10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因

27、为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种 条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先 前使用的不完全一致。25. PCR扩增不出就引物有问题吗？答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决 PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因 片段。有些重复片段的扩增，GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1）RT-PCR。请注意，很多基因通过常规RT -PCR方法是很难扩增出来的。RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在 特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝， 基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。16:14 | 添加评论 | 固定链接 | 写入日