流式细胞仪SOP示例

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1、流式细胞仪操作规程目录1淋巴细胞亚群测定2： HLA-B27 测定淋巴细胞亚群测定（CD系列）方法流式细胞仪 BD）原理：用已知总数的荧光微球 Beads 作标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细胞仪的获取和分析软 件，就可以得出血中 CD3、CD4，CD8、B、NK 细胞的绝对数。,-获取细胞数XBeads总量细胞（/ul） =Beads获取数X样本量标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA 抗凝血要求 1样本量至少 1ml。2 室温放置，24 小时内处理，处理前充分混匀。3 溶血样本不能用。试剂（1）质控品BEKAMAN

2、COULTER产品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于 2-8C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入 20 ul 单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的 100u1 抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育 20-30 分钟4）溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b. 使用 COULTER QPREP 制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮- 开门

3、-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度 批内五次重复 CV2灵敏度 5001000 个荧光素分子参考值（百分数（绝对值） ）CD3+ 60.8-75.4%（1141-1880） CD4+ 29.4-45.8%（478-1072）CD8+ 18.2-32.8%（393-742） NK 9.5-23.5% （175-567）Th/Ts 1.05-2.03临床意义1.T、B 淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、 急性感

4、染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th / Ts比值来判断病人的免疫状况。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶 血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。Th/Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障 碍性贫血、粒细胞减少患者。2： NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等,NK活性随年龄增长而减退。NK

5、细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血 NK 细胞增加。方案（Protocol）HLA-B27 测定（流式细胞仪）医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版（共 3 页）本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审扌批 者: 批准日期：年月日文件分发部门和/或个人院档案室保管者：检验科 主任：检验科实验室：HLA-B27 测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法。将 HLA-B27-FITC/B7-PE 单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合 经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细

6、胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细 胞的平均荧光强度和所占的百分比。标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位 静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求 1样本量至少 1ml。2样本应在采集后 6 小时内处理，冷冻的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在4.0-10.0X109/L之间。若10.0xl09/L,样本需要稀释，用PBS稀释; 若4.0x109/L，应分离单个核细胞。4. 溶血样本不能用。试剂品牌剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML 28C2：全血溶血试剂 液体A ：甲酸 液体 70ML 室温B ：碳酸钠等

7、液体 32ML室温C ：多聚甲醛 液体 14ML室温3 ：鞘液 液体 20L 室温4 ：清洗液液体 5L 室温5：荧光微球 液体10ML 2-8 C质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于 2-8C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照（IgG2a-FITC / IgG1-PE）2）分别向试管中加入混匀的 100u1 抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶

8、血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b. 使用 COULTER QPREP 制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮- 开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）洗、离心、上机测样（备注： 测 B27 一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性操作性能精密度 批内五次重复 CV2灵敏度 5001000个荧光素分子参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB,占人体整个基因的1/3000,HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。方案（Pro toco）