草莓品种‘晶玉’高效离体再生体系的建立

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1、草莓品种晶玉高效离体再生体系的建立向发云，韩永超，曾祥国，顾玉成*(湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉 )摘要：本文以草莓晶玉为试材，研究了不同植物生长调节剂浓度和配比对叶片、叶柄再生的影响，不同暗培养时间对叶片再生的影响，并筛选出了最佳的生根培养基，建立了草莓晶玉的高效离体再生体系。结果表明，MS+TDZ 2.0 mgL-1 +2,4-D 0.05 mgL-1最利于晶玉草莓叶片不定芽的分化，不定芽再生率可达81.45%，每叶块平均再生芽数达到了4.47个；暗培养7天有利于叶片不定芽的再生。而MS+TDZ 3.0 mgL-1 +2,4-D 0.05 mgL-1组合对晶玉叶柄不定芽再生最好。晶

2、玉草莓的最佳生根培养基为1/2 MS+ 0.05 mgL-1 NAA + 0.05 mgL-1 IBA。关键词：草莓；离体再生；叶片；叶柄Establishment of High Efficient Regeneration System of Strawberry Variety Jingyu Xiang Fa-yun, Han Yong-chao, Zeng Xiang-guo, Gu Yu-cheng*(Industrial Crops Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan , China)Abstract

3、： In this paper, we have studied the effects of plant growth regulators and dark incubation in the inducing adventitious shoot of strawberry variety Jingyu. We established high efficient plant regeneration system of Jingyu strawberry. The results showed that the optimum bud differentiation medium of

4、 the leaves from Jingyu was MS supplemented with 2.0 mgL-1 TDZ and 0.05 mgL-1 2,4-D. The adventitious bud differentiation rate was 81.45% and the average regeneration bud number was 4.47 per leaf discs. For Jingyu leaves, 7 days dark treatment increased the rate of adventitious shoot regeneration. F

5、or Jingyu petioles, adventitious shoot regenerated best on MS supplemented with 3.0 mgL-1 TDZ and 0.05 mgL-1 2,4-D. The best rooting medium of Jingyu strawberry was 1/2 MS supplemented with 0.05 mgL-1 NAA and 0.05 mgL-1 IBA.Keywords: strawberry, in vitro regeneration, leaf, petiole晶玉是湖北省农业科学院经济作物研究所

6、以甜查理为母本，晶瑶为父本杂交选育的草莓新品种，于2012年通过湖北省农作物品种审定委员会的审定1。该品种具有品质较优、抗炭疽病和白粉病、丰产性好等优势，是生产上很有潜力的一个栽培品种。建立其高效的再生体系，对于草莓品种的种质交换及进一步的草莓遗传转化研究具有重要意义2-3。国内外对草莓的组织培养再生研究已有一些报道，主要集中在对草莓茎尖快速繁殖，不同品种的叶片、叶柄、花药不定芽再生等方面4-6。在草莓再生的相关研究中涉及的品种主基金项目：国家农业科技成果转化项目（2012GB2D），湖北省农业科技创新中心资助项目（200762000103），武汉市青年科技晨光计划项目（7）作者简介：向发云（

7、1978），男，湖北公安人，助理研究员，硕士，（电话）（电子信箱）xfy323；通讯作者，顾玉成（电子信箱）gych119。要是丰香、全明星、红颊、晶瑶、图德拉等7-9，但具有高效再生体系的优良草莓品种仍然较少，有必要进一步对新审定的草莓品种进行高效再生体系研究。本研究以晶玉叶片、叶柄为试材，研究了不同激素浓度和配比对叶片、叶柄不定芽分化的影响，暗处理对不定芽分化的影响等，建立了高效的晶玉草莓离体再生体系。1 材料与方法1.1 供试材料 晶玉草莓，种植于湖北省农业科学院经济作物研究所草莓试验圃，自田间选取健壮草莓母株上生长充实而小叶尚未展开的匍匐茎顶端约3 cm-4 cm长的顶芽。1.2 无菌

8、材料的获得对匍匐茎顶芽先用自来水将组织器官冲洗干净并擦干，转入超净工作台，按下列程序消毒。用70%的酒精浸润30秒左右，无菌水冲洗一次，然后用0.1% HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗5次。将处理好的顶芽在无菌纸上逐层剥去幼叶取出茎尖生长点，接于MS培养基上生长。茎尖在MS培养基上成活后，在MS+ 0.5 mgL-1 BA+ 0.05 mgL-1 NAA上继代一次，以25天苗龄无菌试管苗的叶片、叶柄为试验材料。1.3 不同浓度的6-BA与IAA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响取长势健壮、三出复叶均展开的的晶玉无菌试管苗叶片，去除叶片边缘部分，切成5x5 mm2左右的小块状叶盘，以近轴面向下

9、与再生培养基接触进行培养。再生培养基以MS+ Sucrose 30 gL-1 + Phytagel 2.5 gL-1、pH 5.8 为基本培养基，分别添加1 mgL-1 、2 mgL-1 、3 mgL-1 的6-BA与0.1 mgL-1 、0.3 mgL-1 、0.5 mgL-1 的IAA激素配比，50 d后进行观察统计，研究不同浓度的6-BA与IAA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响。每个处理80个叶片，每处理重复3次。接种后培养条件为：温度252、光照强度1500-2000 Lx、光照时间16h/d（除暗培养外，下同）。1.4 不同浓度的TDZ与2，4-D组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响

10、同1.3的接种培养方法，以MS+ Sucrose 30 gL-1 + Phytagel 2.5 gL-1、pH 5.8 为基本培养基，分别添加1 mgL-1 、2 mgL-1 、3 mgL-1 的TDZ与0.05 mgL-1 、0.1 mgL-1 、0.2 mgL-1 的2，4-D激素配比，50 d后进行观察统计，研究不同浓度的TDZ与2，4-D组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响。1.5 不同浓度的TDZ与IBA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响同1.3的接种培养方法，以MS+ Sucrose 30 gL-1 + Phytagel 2.5 gL-1、pH 5.8 为基本培养基，分别添加1 mg

11、L-1 、2 mgL-1 、3 mgL-1 的TDZ与0.1 mgL-1 、0.3 mgL-1、0.5 mgL-1 的IBA激素配比，50 d后进行观察统计，研究不同浓度的TDZ与IBA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响。1.6 不同暗培养时间对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响以MS + TDZ 2 mgL-1 + 2，4-D 0.05 mgL-1 + Sucrose 30 gL-1 + Phytagel 2.5 gL-1、pH 5.8 为培养基，叶盘接种后分别进行252下0d、7d、14 d、21 d、28 d的暗处理后，再置于光照强度1500-2000 Lx、光照时间16h/d的光条件下培养，

12、研究不同暗培养时间对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响。每个处理80个叶片，每处理重复3次。1.7 不同浓度激素配比对晶玉草莓叶柄不定芽再生的影响取长势健壮、三出复叶均展开的晶玉无菌试管苗叶柄，切成1cm左右的小段与再生培养基接触进行培养。再生培养基以MS+ Sucrose 30 gL-1 + Phytagel 2.5 gL-1、pH 5.8 为基本培养基，分别添加不同浓度的TDZ 与2，4-D或IBA的配比，50 d后进行统计，研究不同浓度激素配比对晶玉草莓叶柄不定芽再生的影响。每个处理80个叶柄切段，每处理重复3次。接种后培养条件为：温度252、光照强度1500-2000 Lx、光照时间16h/

13、d。1.8 再生小苗生长与植株生根将再生的晶玉草莓不定芽在MS+ 0.5 mgL-1 BA+ 0.05 mgL-1 NAA上继代一次，当不定芽长至3cm左右时，将生长健壮的无根小苗在超净工作台上，接种于不同生根培养基上进行生根培养，25 d后进行观察统计。通过生根率、平均生根数、平均根长、平均根粗等指标综合衡量晶玉草莓的最佳生根培养基。1.9 试验结果观察与数据统计在不定芽再生过程中，持续观察外植体形态变化及不定芽再生情况。培养50d后，统计不同处理不定芽再生频率和每个外植体再生的不定芽个数，计算不定芽再生率及每外植体再生芽数。计算公式如下：不定芽再生频率(%)=再生出不定芽的外植体数/接种的

14、外植体总数100%；每外植体再生芽数=外植体再生出的不定芽总数/再生出不定芽的外植体数100%。试验数据采用Excel2003软件进行分析，应用SAS.0软件进行差异显著性（0.05）分析。2 结果与分析2.1 不同浓度的6-BA与IAA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响表1 不同浓度的6-BA与IAA配比对叶盘再生的影响处理激素组合平均不定芽再生率（%）平均分化芽数A16-BA 1.0+IAA 0.10.000.00 g0.000.00 fA26-BA 1.0+IAA 0.32.050.89 fg1.580.16 deA36-BA 1.0+IAA 0.56.820.38 de2.060.19

15、 bcA46-BA 2.0+IAA 0.14.460.41 ef1.560.18 deA56-BA 2.0+IAA 0.315.170.87 b2.250.27 bA66-BA 2.0+IAA 0.519.051.25 a2.690.11 aA76-BA 3.0+IAA 0.15.310.21 de1.440.27 eA86-BA 3.0+IAA 0.311.942.20 c1.900.08 bcdA96-BA 3.0+IAA 0.58.142.98 d1.760.06 cde注：不同字母表示不同处理间差异显著，P0.05。下表同。晶玉叶盘接种于添加了6-BA与IAA不同浓度组合的再生培养基上

16、，愈伤产生量少,且愈伤多为浅绿色、质地较致密坚硬，30 d左右不定芽开始分化形成。大部分不定芽经愈伤组织分化形成，少量不定芽直接在叶片切口末端形成。如表1所示，不同浓度的6-BA与IAA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的试验中，该组合总体上能够诱导叶片不定芽的再生，但再生频率较低。其中2.0 mgL-1 6-BA+0.5 mgL-1 IAA的组合对晶玉草莓叶片不定芽再生相对较好，再生率达到了 19.05%，与其它处理水平差异显著。2.2 不同浓度的TDZ与2，4-D组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响表2 TDZ与2,4-D对叶盘不定芽再生的影响处理激素组合平均不定芽再生率（%）平均分化芽数B1TD

17、Z 1.0+2,4-D 0.0513.510.56 g2.940.06 efB2TDZ 1.0+2,4-D 0.14.000.63 h2.710.17 fB3TDZ 1.0+2,4-D 0.20.000.00 i0.000.00 gB4TDZ 2.0+2,4-D 0.0581.451.08 a4.470.30 aB5TDZ 2.0+2,4-D 0.136.381.43 d3.930.05 bB6TDZ 2.0+2,4-D 0.222.521.16 f3.180.09 deB7TDZ 3.0+2,4-D 0.0575.371.05 b3.830.11 bcB8TDZ 3.0+2,4-D 0.14

18、6.980.83 c3.470.11 cdB9TDZ 3.0+2,4-D 0.225.230.74 e3.320.27 d从表2可以看出，在同一TDZ水平上，晶玉草莓叶片不定芽再生率随着2，4-D浓度的提高呈显著下降趋势，这说明，培养基中附加低浓度（小于0.1 mgL-1)的2，4-D有利于晶玉叶片不定芽的再生。叶片接种于添加了 TDZ与2，4-D不同浓度组合的再生培养基上，产生愈伤多为黄绿色颗粒状，质地较致密，25 d左右开始形成不定芽。试验结果表明，2.0 mgL-1 TDZ+0.05 mgL-1 2，4-D组合对晶玉叶片不定芽再生最好，再生率达到了 81.45%，显著高于其它处理水平，每

19、叶块平均再生芽数达到了 4.47个。TDZ 3.0 mgL-1+2，4-D 0.05 mgL-1的组合不定芽再生率也较高，但观察发现，当TDZ浓度较高时（大于2.0 mgL-1)，再生出的不定芽玻璃化严重，因此TDZ浓度不宜过高，以2.0 mgL-1为宜。如图1所示，图1-a为晶玉草莓叶盘接种7天后在切口边缘形成明显的黄绿色愈伤，图1-b为晶玉草莓叶盘愈伤再生不定芽。2.3 不同浓度的TDZ与IBA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响在TDZ与IBA不同浓度组合的再生培养基上，晶玉草莓叶片多产生黄绿色颗粒状愈伤、少量为块状，质地致密。30 d左右开始形成不定芽。从表3可以看出，2.0 mgL-1

20、 TDZ+ 0.3 mgL-1 IBA组合对晶玉叶片不定芽再生最好，再生率达到了 55.96%，显著高于其它处理水平，每叶块平均再生芽数达到了3.55个：当TDZ浓度进一步提高(3 mgL-1)时，不定芽再生率开始下降，且不定芽以丛生状为主、长势较弱、玻璃化现象严重。表3 TDZ与IBA对叶盘不定芽再生的影响处理激素组合平均不定芽再生率（%）平均分化芽数C1TDZ 1.0+IBA 0.131.69 1.04 d3.380.37 abC2TDZ 1.0+IBA 0.337.00 0.81 c3.39 0.05 abC3TDZ 1.0+IBA 0.523.72 1.07 e3.12 0.04 bc

21、C4TDZ 2.0+IBA 0.131.75 0.48 d3.57 0.20 aC5TDZ 2.0+IBA 0.355.96 1.80 a3.55 0.09 aC6TDZ 2.0+IBA 0.540.82 1.03 b3.16 0.05 bcC7TDZ 3.0+IBA 0.125.50 0.88 e2.89 0.08 cdC8TDZ 3.0+IBA 0.327.28 2.21 e2.94 0.09 cdC9TDZ 3.0+IBA 0.527.29 3.15 e2.75 0.07 d2.4 不同暗培养时间对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响暗培养对不定芽再生的影响如表4所示，暗培养7天不定芽再生率最高

22、，达到了84.53%，每外植体再生芽数达到了5.01个，显著高于没有暗培养的处理，表明暗培养对不定芽的再生有一定的促进作用。试验观察发现，7天的早期暗培养，可以减轻叶盘切口的褐化现象，这可能是暗培养促进不定芽再生的主要原因。但暗培养时间过长，不利于不定芽的分化再生。表4 暗培养对叶片不定芽再生的影响暗培养时间（天）不定芽再生率（%）每外植体再生芽数079.610.83 bc4.30 0.04 b784.530.46 a5.01 0.04 a1481.740.46 ab3.65 0.07 c2177.860.33 c3.31 0.23 d2845.222.58 d2.90 0.08 e2.5 不

23、同浓度激素配比对晶玉草莓叶柄不定芽再生的影响表5 叶柄不定芽再生的影响处理激素组合平均不定芽再生率（%）平均分化芽数D1TDZ 1.0+2,4-D 0.0510.88 0.09 g1.99 0.25 eD2TDZ 1.0+2,4-D 0.13.66 0.13 h1.26 0.08 fD3TDZ 1.0+2,4-D 0.21.75 0.13 h1.20 0.02 fD4TDZ 2.0+2,4-D 0.0552.82 0.58 b3.34 0.08 aD5TDZ 2.0+2,4-D 0.148.89 0.29 c2.99 0.09 bcD6TDZ 2.0+2,4-D 0.232.86 0.55 e

24、2.77 0.05 bcD7TDZ 3.0+2,4-D 0.0557.83 1.71 a3.59 0.09 aD8TDZ 3.0+2,4-D 0.148.86 0.40 c3.48 0.18 aD9TDZ 3.0+2,4-D 0.237.52 1.50 d2.86 0.05 bcD10TDZ 1.5+IBA0.128.60 1.13 f2.69 0.23 cD11TDZ 1.5+IBA0.231.52 1.53 ef2.32 0.13 dD12TDZ 2.0+IBA0.133.99 1.69 e2.99 0.10 bcD13TDZ 2.0+IBA0.237.50 3.24 d3.03 0.14

25、 b不同浓度激素配比对晶玉草莓叶柄不定芽再生的影响，结果如表5所示， 在13种激素组合中，3.0 mgL-1 TDZ+0.05 mgL-1 2，4-D组合对晶玉叶柄不定芽再生最好，再生率达到了 57.83%，显著高于其它处理水平，每叶块平均再生芽数达到了 3.59个。草莓叶柄不定芽再生如图1所示，其中图1-c 晶玉草莓叶柄接种7天后在切段两端形成明显的黄绿色块状愈伤，图1-d为叶柄愈伤再生不定芽。2.6 不同生根培养基对晶玉草莓植株生根的影响再生出来的草莓不定芽，在继代培养基上培养一次后生长成小植株，如图1-e所示。在如表6所示的7种生根培养基中，从生根率、平均生根数、平均根长、平均根粗等指标

26、综合考虑，晶玉草莓的最佳生根培养基为1/2 MS+ 0.05 mgL-1 NAA + 0.05 mgL-1 IBA，其生根率、平均生根数、平均根长、平均根粗分别达到了99.33%、11.67个、3.04 cm、0.80 mm。不定芽生根形成的完成植株如图1-f所示。表6 不同培养基对晶玉草莓植株生根的影响培养基生根率(%)平均生根数平均根长（cm）平均根粗（mm）MS94.671.11 d8.630.11 d3.160.05 a0.670.04 bc1/2 MS95.671.11 cd7.670.16 e2.850.08 b0.600.00 c1/2 MS+NAA 0.0596.671.11

27、bc9.230.11 c2.440.08 c0.800.07 a1/2 MS+NAA 0.195.670.44 cd8.800.13 cd2.470.04 c0.830.04 a1/2 MS+IBA 0.0598.330.44 ab11.370.38 ab2.470.10 c0.800.00 a1/2 MS+ IBA 0.197.000.67 bc11.130.22 b2.530.04 c0.770.04 ab1/2 MS+NAA 0.05+IBA 0.0599.330.44 a11.670.04 a3.040.05 a0.800.00 a3 讨论影响草莓再生的因素较多，其中草莓品种自身特性、

28、培养基、不同激素的种类和浓度配比等是最关键的几个因子。近几年，湖北省草莓育苗期炭疽病病害发生严重10，而晶玉是一个对炭疽病具有较高抗性的品种，其在生产上应用潜力较大。晶玉高效的再生体系对于种质交换及进一步的草莓遗传转化研究具有重要意义。激素种类和配比是影响外植体器官发生的重要因素。在离体培养中一般生长素有利于根的形成，而细胞分裂素有利于芽的形成，通过改变二者的比例可以调节芽的形成。在各种类型的激素组合实验中，以TDZ与生长素配合使用时 “晶玉”草莓再生频率较高，这可能与TDZ强烈的细胞分裂素活性有关。本研究建立了晶玉草莓的高效离体再生体系。其中，2.0 mgL-1 TDZ+0.05 mgL-1

29、 2，4-D组合对晶玉叶片不定芽再生最好，再生率达到了 81.45%；3.0 mgL-1 TDZ+0.05 mgL-1 2，4-D组合对晶玉叶柄不定芽再生最好。暗培养也是影响草莓叶片再生率高低的重要因素之一。有相关报道指出：草莓不同品种再生所需要的合适的暗培养时间各有不同，丰香最佳暗培养时间是2周，吐德拉是3周，幸香是6周。本研究结果表明晶玉草莓叶片再生最佳的暗培养时间是7d左右，。暗培养的主要作用是让外植体在再生过程中减少溢出酚类物质、减轻褐化，维持植物材料较好的生理状态11-12，因而对再生有利。参考文献1 向发云，曾祥国，冯小明，等草莓新品种晶玉J园艺学报 2012，39（12）：252

30、325242 Gruchala A，Malgorzata K，Edward ZConditions of transformation and regeneration of Induka and Elista strawberry plantsPlant Cell，Tissue and Organ Culture，2004,79：153-l603 尹淑萍，金万梅，王萍孟，等Thidiazuron对草莓外植体再生不定芽的影响J农业生物技术学报，2003，11(4) :379-382 4 凤 婷，赵密珍，王 钰，等草莓品种宁玉再生体系的建立J江苏农业学报，2013，29(3) ：688-6905

31、 向发云，曾祥国，冯小明，等影响丰香草莓花药培养再生的几个主要因素A张运涛草莓研究进展（三）M北京：中国农业出版社，201043-476 张志宏，吴禄平，代红艳，等草莓主栽品种再生和转化的研究J园艺学报，2001,28(3):189-1937秦永华，张上隆，徐 凯，等丰香草莓叶片高效再生体系的建立J园艺学报，2005,32(1):189-1938 向发云，吴金平，曾祥国，等“晶瑶草莓叶片再生体系的建立J江西农业学报，2010，22(11)：28-319吴雪梅，汤浩茹，文国琴，等不同培养条件对丰香草莓离体叶片再生的影响J园艺学报，2004,31(5):657-65910 向发云，韩永超，曾祥国湖

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