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1、PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。其扩增过程包括三 个连续步骤：（1）变性，对双链DNA模板进行加热，使其解离；（2）退火，被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合；（3）延伸，DNA聚合酶沿着模板链将引物3端进行延伸。将这些步骤重复（“循环”）25-35 次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝伽W葩DHApg ngpg ng0.5 5 50 0.5 5 5080 400 2 10 50 250PCR的成功取决于一系列因素。其中，反应组分在扩增中起到至关重要的作用。以下列出 了配制反应体系时，所需考虑的关键因素：模板DNA用于复制的PCR模板可以是
2、任何DNA来源，如基因组DNA （gDNA）、互补DNA （cDNA） 和质粒DNA。不过，DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如，在起始量 为50 的PCR中，只需0.1-1 ng质粒DNA，而gDNA则需要5-50 ng。最佳模板起始量还 取决于所使用的DNA聚合酶类型；经过改造的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度 更高，所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要，因为起始量过高会增加发生 非特异性扩增的风险，而起始量过低会降低得率（图1）。S仁质粒和人类gDNA模板的PCR结果对比。在 建议条件下，使用相同的DNA聚合酶从不同起始 量的DNA摸板中旷增2 kb
3、目标序列.有时候，PCR实验方案会使用拷贝数表示DNA起始量，特别是gDNA。拷贝数的计算取 决于分子的数量，即DNA起始摩尔量。用Avogadro常数（L）和摩尔质量计算拷贝数，公 式如下：拷贝数=L x摩尔数=L x （总质量/摩尔质量）特定DNA链的摩尔质量取决于其大小或总碱基数（即，其长度和单链或双链特性的组 合）。为了简便，可使用在线工具 从起始DNA的质量计算拷贝数。理论上，单拷贝DNA或单个细胞在理想条件下足够用于PCR扩增。但在实际情况中， 特定模板量的扩增效率很大程度上取决于反应组分和反应参数，以及DNA聚合酶的灵敏度。 除了 gDNA、cDNA和质粒DNA，可通过再次扩增P
4、CR产物，得到更高的目标DNA得率。尽 管未纯化的PCR产物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、盐和副产物等遗留反应成 分会对扩增造成不利影响。为了避免这种抑制作用，通常建议在下一轮PCR前用水稀释反 应。如需获取最佳结果，应在再次扩增前将PCR扩增子进行纯化。使用经优化的PCR纯化 试剂盒，仅需5分钟即可完成PCR产物纯化步骤。DNA聚合酶DNA聚合酶在目标DNA的复制中至关重要oTaqDNA聚合酶应该算是最广为人知的PCR 聚合酶了它的发现 彻底改变了 PCR。 TaqDNA 聚合酶具有相对较高的热稳定性，在 95C 下的半衰期约为40分钟1。在70C时能够以每秒60个碱基的速度引入
5、核苷酸，扩增长度 约为5 kb,因此，它适用于无特殊要求的常规PCR。如今，新一代DNA聚合酶经过改进, PCR 性能有了明显改善。一般在50反应中，1-2单位的DNA聚合酶已足够用于目标DNA的扩增。但是，对于 难扩增模板，则需要调整酶的使用量。例如，当DNA样品含有抑制剂时，增加DNA聚合酶 使用量有助于提高PCR得率。但是注意，提高酶浓度可能会产生非特异性PCR产物（图2） o 对于PCR克隆、长片段扩增和高GC含量PCR等更为特殊的应用，应该使用性能更高的DNA 聚合酶。这些酶能够在短时间内从长模板上扩增出PCR产物，错误率更低，得率更高，对 抑制剂的耐受性更强。引物PCR引物是含有1
6、5-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧 翼序列结合（通过序列互补）。在PCR反应期间，DNA聚合酶从3端开始延伸引物。因此， 引物结合位点必须是靶标附近所特有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源 性，以确保目的片段的特异性扩增。除了序列同源性，引物还必须考虑到其它相关问题，以确保PCR扩增的特异性。首 先，引物序列的熔解温度（Tm）必须在55-70C之间，两种引物的Tm相差不超过5C。 同样重要的是，引物的序列不能具有互补性（特别是3末端） ，若两个引物互补会促进退火 （即，引物二聚体），自我互补会导致自我配对（即，二级结构），或序列的直接重复会导 致与
7、模板目标区域产生不完全配对。此外，引物的GC含量最好在40-60%之间，均匀的C和G分布能够避免错误发生。同 样，为了尽量减少非特异性，引物3端最多只能含有3个G或C碱基。另一方面，引物3, 端含有 1 个 C 或 G 核苷酸有利于引物的锚定和延伸（表 1）。表1.PCR引物设计的一般建议.可以不可以长度为15-30 nt-讣5-70七（两施|物应不融5-C） 4060%GC （均匀分布）-3，有1个C或G二 （互补性）-直接重复序列-3，有3个OG或C长序列引物（如，50 nt）或碱基经修饰的引物通常需要进行纯化，以去除非全长 产物和未结合的核苷酸。对于分子克隆和突变等应用，建议将引物进行纯
8、化，序列和长度的 完整性对于实验的成功至关重要。为PCR克隆设计引物时，可在5末端引入限制性酶切位点、重组序列和启动子结合位 点等延伸的非模板序列。这些延伸序列需进行精心设计，以尽量减小对PCR扩增和下游实 验应用的影响。在配制PCR反应体系时，引物加入量应在0.1-1 yM范围内。对于含有简并碱基或用于 长片段PCR扩增的引物，常用的引物浓度为0.3-1 yM。通常，建议先使用标准浓度，然后 根据需要再进行调整。引物浓度过高容易产生错配和非特异性扩增。而引物浓度过低可能会 导致目的片段的少量扩增或无扩增（图 3）。Primer concentration (pM, each)Nonspeci
9、fic products and primer-dimers图3.使用不同浓度的引物对人类gDNA逬行PCR扩熠。在该实验中，对富含GC的0 7 2片段进行扩增.可以观察到，在高引物浓度下，会产生非 特异性产物和引物二聚体。脱氧核苷三磷酸（dNTP）。dNTP由四个基本核苷酸组成dATP、dCTP、dGTP和dTTP是新DNA链的组成元 件。这四种核苷酸通常以相等摩尔量加入到PCR反应体系中，以实现最佳的碱基引入。但 是，在某些情况下，如通过PCR方法进行随机突变，偶尔也会使用浓度不等的dNTP，以促 进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。在常见的PCR应用中，各种dNTP的常用终浓度通
10、常为0.2 mM。有时，使用高浓度dNTP 也可能也是有益的，特别是在存在高浓度Mg2+的情况下，因为Mg2+可与dNTP结合，减 少可被引入的dNTP量。但同时，当dNTP超过最佳浓度时，会抑制PCR反应。为使DNA聚 合酶完成有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不得超过0.010 - 0.015 mM （其估计Km值）（图4）。当使用非校正DNA聚合酶时，可通过降低dNTP浓度（0.01 - 0.05 mM）和成比例减少Mg2+来提高保真度。在一些应用中，dNTPs可能包含特殊核苷酸。例如，使用脱氧尿苷三磷酸dUTP）替代 dTTP，结合使用尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）预处理，以防止残余PC
11、R产物污染2。UDG是 一种DNA修复酶，能够剪切含有尿嘧啶的DNA链。使用dUTP替代dTTP，会生成含有尿嘧 啶的PCR产物。在开始PCR前，使用UDG孵育反应样品，能够去除含有尿嘧啶的污染性残 余PCR产物，从而防止残余PCR产物引起假阳性结果（图5）。No amplification图5.通过UDG处理.防止残余PCR扩堵子污染。UDG切割DNA片段中的尿吨喘碱基（红色线条）.经切割的DNA链在PCR条件下易于降解因此 不会在后续PCR中扩壻.在PCR中使用dUTP时，应注意如下事项。第一，dUTP取代可能会降低PCR效率和灵 敏度。为克服这一问题，可采用最佳的dTTP和dUTP比例，
12、使每个PCR产物分子携带足量 的尿嘧啶碱基以有效完成UDG处理，而且不会明显影响PCR效率。第二，尽管Taq DNA聚 合酶能够在DNA合成期间掺入dUTP，但Pfu等校正DNA聚合酶不能兼容dUTP，除非经过 特殊改造而可耐受尿嘧啶。这种特性主要是因为基于Archaea的DNA聚合酶具有尿嘧啶结 合口袋作为DNA修复机制3,4。同样，氨基化dUTP、荧光素-12-dUTP、5-溴-dUTP和生物素-11-dUTP等改良型dNTP常 被用于为后续实验加入标记物。与dUTP相似，DNA聚合酶必须能够引入经修饰的dNTP， 以获得成功的 PCR。镁离子（Mg2+）镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶
13、活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶 活性位点处的镁离子可催化引物的3-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键（图6）。 此外，Mg2+能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物（图 8） 5。图6.DNA聚合81活性位点处镁离子的作用。在DNA聚合期相互作用。间，Mg2*可帮助协调引物的39H与dNTP的磷酸基团间发生通常情况下，Mg2+以MgCI2的形式提供。但是，因硫酸盐在某些情况下有助于确保 更稳定和可重现的性能，诸如Pfu DNA聚合酶等一些聚合酶首选MgS04。由于镁离子能够 与dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）结合，因此，通常需要
14、对镁离子浓度进行优 化，以尽量提高PCR得率，并保持其扩增特异性。在PCR中，标准的Mg2+终浓度范围为1 4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。Mg2+ 浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面，Mg2+浓度过 高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入 导致的复制错误（图 7）。缓冲液PCR缓冲液能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5, 般使用Tris-HCI来调节。对于Taq DNA聚合酶，缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子（K+）,其可促进引 物的吸附。有时，也可使用硫酸铵
15、NH4）2SO4代替KCl。铵离子（NH4+）具有去稳定作用，尤 其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性（图8）。StabilizationStabilization图&煖冲版离子对DNA双链形成的影晌。钾离子和镁离子（K+和Mg2+）能够与DNA骨架上的磷酸基团（PJ结合并稳主双链形成，而镀离子（NHf） 能够与碱基（N）之间的氢健相互作用并破坏双链形成”由于Mg2+与K+具有相似的稳定效应，因此，当使用KCI缓冲液时，MgCI2的建议浓 度通常较低（1.5 士 0.25 mM），当使用（NH4）2SO4缓冲液时，MgCI2的建议浓度通常较高（2.0 士 0.5
16、mM）。由于NH4+与Mg2+具有拮抗效应，因此，在各种Mg2+浓度下，含有（NH4）2SO4 的缓冲液都表现出更高的引物特异性（图9）。由于最佳的PCR缓冲液取决于所使用的DNA 聚合酶类型 ，所以有必要遵循酶供应商的提供的缓冲液建议。圉9.使用含不同MgCb浓度的两种不同缓冲萩获得的PCR结杲，表明选择合适缓冲液对于PCR扩壇特异性的重要性。在该反应中，使用Taq DNA 聚合酶从人类gDNA扩塔0 95 e的片段.在某些情况下，可在缓冲液中加入化学添加剂或辅助溶剂，通过减少错配来提高扩增特 异性，并通过去除二级结构来提高扩增效率（表2）。此外，一些DNA聚合酶还随附提供 了专为DNA聚合
17、酶和PCR缓冲液优化的特殊增强剂。这些试剂常用于困难样品，如富含 GC的模板。应注意，使用化学添加剂或辅助溶剂会影响引物退火、模板变性、Mg2+结合 以及酶活性。同时，它们还会干扰某些下游应用例如，基因芯片实验中的非离子去污剂。 因此，为了成功进行PCR扩增和下游实验应用，应慎重考虑缓冲液组成成分。表2.用作PCR增强剂的常见添加剂或辅助溶剂，以及其建议终浓度6。试剂标准终浓度二甲皋吓飒(DMSO)1-10%甘油5-20%甲酰胺1.25-10%牛血清白蛋白(BSA)10-100 pg/mL硫酸钱(NH4)2SO4)15-30 mM聚乙二醇(PEG)5-15%.明胶0.01%非离污剂(如，Tween 20, Triton X-100)0.05-01%N,N,N-二甲基甘氨酸(甜菜碱)1-3 M
PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程
