小麦粉及其制品中氨基脲的测定(BJS 201902)

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1、附件2小麦粉及其制品中氨基脲的测定BJS 2019021 范围本方法规定了小麦粉及其制品中氨基脲残留的液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于小麦粉及以小麦粉为主要原料的各种制品中氨基脲残留量的检测。2 原理试样经盐酸水解，邻硝基苯甲醛过夜衍生，乙酸乙酯提取，旋蒸富集后，采用高效液相色谱/串联质谱仪进行定性检测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。3 试剂和材料注：水为 GB/T 6682 规定的一级水。3.1 试剂3.1.1甲醇（CH4O）：色谱纯。3.1.2乙腈（C2H3N）：色谱纯。3.1.3乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。3.1.4乙酸铵（C2H7 NO2）：色谱纯。3.1.5正己烷（

2、CH“）：色谱纯。6 143.1.6盐酸（HC1）：分析纯。3.1.7邻硝基苯甲醛（C7H5NO3）：色谱纯。3.1.8 0.2 moL/L盐酸溶液：准确量取盐酸（3.1.6） 17 mL于1 L容量瓶中，用水定容至1 L。3.1.9 0.1 moL/L邻硝基苯甲醛溶液：称取1.5 g邻硝基苯甲醛（3.1.7）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100 mL。3.1.10乙腈饱和的正己烷：量取正己烷（3.1.5） 80 mL于100 mL分液漏斗中，加入适量乙腈（3.1.2）后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈即可。3.1.11 0.010 moL/L乙酸铵：准确称取0.772 g乙酸铵

3、（3.1.4）于1 L容量瓶中，用水定容至1 L。3.1.12 10%甲醇水溶液：准确量取10 mL甲醇（3.1.1）于1 L容量瓶中，用水定容至100 mL。3.2 标准品氨基脲及其同位素内标标准品的基本信息见表1,纯度9.0%。表 1 氨基脲及其同位素内标标准品的基本信息中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量氨基脲盐酸盐Semicarbazide Hydrochloride563-41-7CH6ClN3O111.53氨基脲-13C,15N2 盐酸盐Semicarbazide-13C,15N2Hydrochloride1173020-16-0CH6ClN3O114.563.3 标准溶液

4、配置3.3.1标准储备液：准确称取14.9 mg （精确到O.OOOlg）氨基脲盐酸盐标准品，置于50 mL 棕色容量瓶中，用甲醇（ 3 . 1 . 1 ）溶解并定容至刻度，配成浓度为200 mg/L 的标准储备液， -18C保存，存效期三个月。3.3.2内标标准储备液：准确称取14.7 mg （精确到O.OOOlg）氨基脲-兀严比 盐酸盐标准品， 置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成浓度为200 mg/L的标 准储备液，-18C保存，存效期三个月。3.3.3标准工作液：准确量取0.2 mL标准储备液（3.3.1），置于200 mL棕色容量瓶中，用甲 醇（3.

5、1.1）溶解并定容至刻度，配成浓度为0.200 mg/L的标准工作液，-18C保存，存效期 一个月。3.3.4内标工作液：准确量取0.2 mL内标标准储备液（3.3.2）,置于200 mL棕色容量瓶中， 用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成浓度为0.200 mg/L的内标工作液，-18C保存，存 效期一个月。4 仪器与设备4.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。4.2天平：感量分别为0.0001 g和0.01 go4.3 超声波发生器。4.4旋转蒸发仪。4.5离心机。4.5恒温箱。4.6涡旋混合器。4.7高速离心机。5 分析步骤5.1 试样制备从原始样品中取出有代表性样品约500

6、 g，充分混匀，均分成两份，分别装入干净密封袋 作为试样，密封，并注明标记。将试样置于室内避光保存。5.1.1 衍生化称取约2.0 g （精确至0.01 g）样品，置于50 mL玻璃比色管中，加入10 mL 0.2 moL/L 盐酸（3.1.8），涡旋30s后，在依次加入内标工作液（3.3.4） 50此，0.1 moL/L邻硝基苯甲 醛溶液（3.1.9） 200此，超声提取10 min,置37C恒温箱中过夜（16h）反应。5.1.2提取衍生后加入乙酸乙酯（3.1.3）50 mL，具塞后剧烈震摇1 min，超声提取10 min，用10 mL 移液枪吸取上清液40 mL至100 mL蒸发瓶中，并将

7、其接至旋转器上，于45C水浴中减压蒸 馏至干，加入2 mL10%甲醇水溶液（3.1.12）充分溶解，含油脂的样品用4 mL乙腈饱和的 正己烷（3.1.10）液液分配，除去脂肪，1OOOO r/min离心5 min,过0.20 gm有机滤膜后，液 相色谱-串联质谱测定。5.1.3 基质标准溶液制备分别称取5份，每份约2.0 g （精确至0.01 g）阴性样品，分别置于50 mL玻璃比色管 中，均加入10 mL 0.2 moL/L盐酸（3.1.8），涡旋30 s后，分别加入标准工作液（3.3.3）10 gL、 20 gL、50 gL、100 gL、200 gL,添加浓度分别为 1 gg/kg、2

8、gg/kg、5 gg/kg、10 gg/kg、20gg/kg, 再加入内标工作液（3.3.4）50 gL （即内标含量为5 gg/kg），余下操作同5.1.1和5.1.2。当样 品浓度超出线性范围时，基质标准溶液的浓度可根据需要进行调整。5.2 仪器参考条件5.2.1 液相色谱条件a）色谱柱：MGIII-C8柱，150 mmx2.1 mm （i.d.）, 5.0 gm,或性能相当者；b）柱温：25C；c）进样量：10 gL；d）流动相及洗脱条件见表2。表 2 流动相及线性梯度洗脱条件时间/min流动相A （甲醇）流动相B （0.010 moL/L乙酸铵）015%85%355%45%1155%4

9、5%11.115%85%1515%85%e）流动相流速：0.3 mL/min。5.2.2 质谱条件a）离子源：电喷雾离子源（ESI）；b）扫描方式：正离子模式；c）检测方式：多反应监测（MRM）；d）干燥气温度：340C；e）干燥气流速：8 L/min；f）雾化器压力；40 psi；g）毛细管电压：4 000 V；i）定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表3。表3多反应监测（MRM）条件被测物质名称母离子子离子碎裂电压/ V碰撞能量/ eV氨基脲209166； 192*10010/10氨基脲同位素内标212.4195.11205注：*为定性离子5.3 定性测定被测目标化合物选择一个母离子，2 个

10、以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物 质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在2.5%之内；且样品中被测组分定性离子 的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表4 规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测目标化合物。基质标准溶液的液相色谱/串 联质谱色谱图见附录A的图A.1。表4 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（） 50 20-50 10-2010允许的最大偏差（%） 20 25 30 505.4 定量测定5.4.1 标准曲线的制作按浓度由小到大的顺序，将基质标准溶液（5.1.3）分别注入高效液相色谱/串联质谱仪 中，按仪器参考

11、条件（5.2）进行测定，测定氨基脲及其内标峰面积，以基质标准溶液中目 标化合物的浓度和内标的浓度的比值为横坐标，以目标化合物峰面积与内标峰面积的比值为 纵坐标，绘制标准曲线。5.4.2 试样溶液的测定将试样溶液（5.1.2）注入高效液相色谱/串联质谱仪中，按仪器参考条件（5.2）进行测 定，得到相应的样品溶液和内标物的色谱峰面积比值。利用根据标准曲线得到试样测定溶液 中待测组分的浓度，平行测定次数不少于两次。5.5 空白试验除不称取试样外，均按照以上步骤进行。6 结果计算试样中氨基脲含量按式（1）计算：X=p （1）式中：X 一试样中氨基脲的含量，单位为微克每千克（卩g/kg）;p 由标准曲线

12、得到的试样中氨基脲的浓度，单位为微克每千克（卩g/kg）; 注：计算结果需将空白值扣除,测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8 其他本方法对小麦粉及其制品中氨基脲残留的检出限为0.5卩g/kg,定量限为1.0卩g/kg。本方法在加标量为1.0 gg/kg10.0 gg/kg内，加标回收率为75.0%105.3%。 空白试验，应无干扰。附录 A氨基脲特征离子质量色谱图图 A.1 氨基脲及其同位素内标标准溶液的 MRM 色谱图1. 氨基脲；2. 氨基脲同位素内标本方法负责起草单位：北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）。验证单位：山东省食品药品检验研究院、河北省食品检验研究院、国家食品质量监督检验中心（上海）、北京市理化测试分析中心、北京市产品质量监督检验院。主要起草人：耿健强、王浩、贾婧怡、陈江龙、张杉、赵文霞。