小鼠肿瘤模型

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1、肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤 模型。其中用 得最多的是皮下模型， 另外还有腹水 （或者尾静脉注射） 以及原位模型，其他 的模型很少用，就不提他们了。小鼠模型分三大类：第一类是以 S180、 EAC、H22 等为代表的， 他们的宿 主小鼠多选用KM可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水， 经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵 后第二天开 始给药，给药 7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。1. 关于构建瘤种可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至13X 106/mouse,接种 即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml 一次性注射的针头。

2、2. 关于腹水传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约 89 天左右），可以传 代，传代 时取1ml注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹 水即可， 注意不要把针头插得很深， 尽量浅一点， 还可以把老鼠拎起来，利用 重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般 抽个就可以了，不用离心，直接用 P BS3 6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的， 但是血性腹水说 明不好，需 要注意调整，第二代以后，尽量 67 天的时候传代，不要 等的时间太久，否则 腹水容易血性。三代后可用于试验。3. 关于接种进行试验这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种

3、鼠后，小心 地用消毒眼 科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用 镊子（最好是哪种前面 有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部 的肌肉，用剪刀剪开一个小口， 然 后用玻璃滴管或者去掉针头的注射 器吸取腹水。然后进过一定的稀释后，接种到 小鼠的腋下。关于稀释 量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的 时候可以适 当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。 接种部位在小鼠腋 下， 但是不要深入到腋窝里面， 会给以后的操作带来麻烦。 接种时的进针 处离 接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接 种的时候喜欢针 头向上用力， 紧贴着表皮往里走， 然后注射的时候感

4、觉阻力较大，打出来的皮 丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤 严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。 也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉 严重粘连。应该在两者之间，进针的感觉轻松自 如，针头很自由，虽 然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。4. 关于观测指标主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经 是接种后的 第 6 天左右了，第 10 天就结束时间，瘤体积的数据意义 就不大。小鼠肿瘤很 难剥，这是没有办法的，只能耐心，没有太好的 办法，剥多了以后，手上会掌握 一些巧力，有一些帮助，但是我们还 是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围 经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色

5、的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不 要把它弄 破，会严重影响瘤重。按照SFDA勺规定，平均瘤重小于lg,或者单个瘤重小于 200mg认为肿瘤生长不良，试验作废。小鼠模型第二类是以lewis肺癌、B16为代表勺，他们勺宿主多为C57。不产生腹水，只能皮下生长。多用插块法或者匀浆法传代和 接种做试 验。有一种做法也是接种后第二天开始给药， 是接种三天后 给药，接种后两周结束试验，剥取肿瘤称重。还有一种做法1. 关于瘤种构建 体外细胞株，培养后PBS悬浮至13X 106/site，接种至小鼠腋下，即可。2. 关于传代与接种剥取肿瘤，在PBS中取出肿瘤表面包膜和中心的坏死部分，剪刀 剪成小块， 小

6、块大小以套管针勺针口为标准。 用镊子将小块从针头处 塞进 1820号的套管 针，接种至小鼠腋下， 用套管针中间的实体针将 瘤块推出即可。还可以在上述肿瘤组织剪成小块后，用玻璃匀浆器匀浆后， 200目筛网过滤，收集滤液，活细胞计数，PBS稀释后用注射器接种，稀 释量也需要 各个实验室自己摸索。也是三代后可用于试验。3. 关于观测指标 可以在出瘤后测量瘤体积，但是主要还是考察瘤重。小鼠模型第三类是以 P388、L1210 为代表的白血病模型。宿主为DBA2也有人用C57与DBA2的F1代传代，DBA2用于试验，但是我们两种宿主都传过代，没有发现有什么区别。他们能形成腹水，一般 不用于皮下 接种试验

7、， 平时多用腹水传代， 实验时多用腹腔接种或尾 静脉接种考察生存时 间。也是接种后第二天开始给药 这个就不细说了，很多可以参考第一类，主要几 点就是，他们的腹水 都是血性的。另外，腹水量也不多，有的时候可以先注射一 到两毫升 的PBS后，再抽取。肿瘤模型构建小鼠模型分三大类 第一类是以S180EACH22等为代表的，他们的宿主小鼠多选 用KM可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经 过一 定稀释后皮下接种构建模型， 接种后第二天开始给药 （这里与指 导原则相悖， 指导原则要求肿瘤长至 100-300立方毫米时才给药），给药7到10天，接种 10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。

8、1. 构建瘤种 可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至13X 106/mouse,接种 即可,最好用6号左右的针头，就是常用的2ml 一次性注射的针头。细胞悬 液接种时 要选活力好的细胞，就是对数期。细胞生长至瓶底 7080%满的时候认为是对数生长期。2. 腹水传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约 89天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直 接将针头插 入抽取腹水即可， 注意不要把针头插得很深， 尽量浅一点， 还可以把老鼠拎起 来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般 抽个就可以了，不用离心，直 接用P BS3 6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，

9、腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的， 但是血性腹水说 明不好，需 要注意调整。第二代以后，尽量 67天的时候传代，不要等的时间太久，否则 腹水容易血性。 三代后可用于试验。 腹水瘤接种时， 接种量不要太高，1* 107/ml,即可，多按1：3用生理盐水稀释，否则有可能腹水血性。超过 7 天的腹水再传代，动物的周龄太大（ 6 周）, 传代次数太多也 很容易出 现血性腹水。一般小鼠肿瘤模型都控制在 30 多代以内（也 有说 50 多代的）。 出现血性以后可以调整一下：血性腹水可以离心 后加的 NH4CL 容液破红细胞，然 后精确控制条件（接种量，传代时间, 动物周龄等） 传几代， 很多情况下再传

10、一 两代后会有无腹水血性的种 鼠出现，然后用这只种鼠的腹水继续传代。腹水难抽有几种情况，要么接种天数不够，腹水不够多，一般要 等动物肚子 很大了才去抽。 要么就是压力的问题。 有的动物腹水很稠。这时可撕开小鼠肚子，拿掉针头，直接抽干净，最多的时候可抽到5ml。3. 接种这个时候抽取的腹水需要量比较多， 有时需要处死种鼠后， 小心 地用消毒 眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用 镊子（最好是哪种前 面有倒勾的 镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹 部的肌肉， 用剪刀剪开一个小 口， 然后用玻璃滴管或者去掉针头的注 射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后， 接种到小鼠的腋下。关于稀 释量，各

11、个实验室的情况都不一样，最好摸索一下， 开始的时候可以 适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数 （计数的时候要 注意， 有一些很细小的细胞是血细胞，不要计数）。如果接种细胞量偏大会 造成 肿瘤早期就溃烂， 所以不要为了追求肿瘤生长速度而一味的提高 接种细胞量。接 种部位在小鼠腋下，但是不要深入到 腋窝里面，会 给以后的操作带来麻烦。可以 往尾部或背部靠一些，不要往腹部靠， 容易使肿瘤被垫料磨烂。接种部位可以选 择腋下或者后肢 , 有的文章 说是背部接种 ,但是背部血管不发达 ,营养不够,一 般不建议采用 .接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容 易污染。有 的人接种的时候

12、喜欢针头向上用力， 紧贴着表皮往 里走， 然后注射的时候感觉 阻力较大， 打出来的皮丘又紧又圆， 这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连， 不利于最后肿瘤的剥取。 也不要紧靠肌肉， 肿瘤会 与肌肉严重粘连。 应该在两者之间， 接种的时候要精确控制接 种在皮下，进针 深度左右 , 针头沿皮肤水平进入 , 然后挑起表皮 , 注 射。进针的感觉轻松自 如， 针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆 很漂亮，但是相对好剥取一些。防止接种的时候老鼠乱动，正确手法是用拇指和食指捏住老鼠的 颈部皮肤， 无名指和手掌下部把老鼠的后肢捏住， 捏颈部的时候手指 尽量多捏一点皮肤，然 后右手（你是左手抓动物的话）拉住后肢，

13、尽 量往下拉，让老鼠的身体伸展开 来，在用无名指固定，中指可以放在 老鼠的身体下面，适当的往上顶，使老鼠的 腋下一代完全平展，皮肤 不用绷得太紧，平展就可以了，另外接种的时候进针点 很靠下，针头 在皮下走一段再注射，速度不要太快。注射前针头稍微动一动，能 动 就说明在皮下，否则可能 在皮内或者肌肉内。一般来说都是有鼓包 的但是要 是你接种位置太深入腋窝， 你是看不到鼓包的。 主要靠针头 稍微动一动来判 断。4. 观测指标主要是按时称体重， 试验结束后剥取肿瘤称瘤重。 因为出瘤已经 是接种后 的第 6 天左右了，第 10 天就结束时间，瘤体积的数据意义 就不大。小鼠肿瘤 很难剥， 只能耐心，没有

14、太好的办法， 剥多了以后， 手上会掌握一些巧力， 有 一些帮助， 但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围经常会有一些血窦的形成， 弄破后会有血和黄 色的液体流 出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破，会严重影 响瘤重。按照SFDA的 规定，平均瘤重小于1 g,或者单个瘤重 小于200mg认为肿瘤生长不良，试验作废。第二类是以lewis肺癌、B16为代表的，他们的宿主多为C57。不产生腹水，只能皮下生长。多用插块法或者匀浆法传代和接种。有一种 做法也是接 种后第二天开始给药，还有一种做法是接种三天后给药， 接种后两周结束试验， 剥取肿瘤称重。1. 瘤种构建体外细胞株，培养后PBS悬浮

15、至1 3X 106/site,接种至小鼠腋下，即可。2. 传代与接种体内瘤源用于传代接种，有两种手段（均为无菌操作），套管针 插块法对瘤组织损伤小，可能 100成瘤。匀浆法对瘤组织损伤大，成瘤可能小于 100。1） 插块法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于 在 PBS 或菌氯化钠注射液中洗涤干净，然后剪开，去处中心颜色 变暗坏死部分，以及 外表的包膜（如果比较明显的话），选外围发亮 部分。清洗干净，然后换到干净 的 PBS 中，用剪刀剪成 Imm 直径左右 的小块，最后用镊子将小块从针头处塞进 1820 号的接种套管针 （最好用的是胸膜活检针 20 号，但是现在已经买不到了，可以

16、用硬脊膜 外穿刺针18 号磨平针头后代替），在老鼠的皮肤上剪一小口，接种 于动物腋下或者其他 部位。塞的组织块的量以接种针头的口径为准， 不能太紧也不能太松， 以孔径为 标尺，尽量保持差不多大小的接种量。如出现出针挂组织的问题， 关键在于针头的磨制， 在针后部的小突起于小缺口吻合后， 实体针弯曲方向应该与套管针磨制的斜面一致， 接种时，实体针要推到底，也就是后针头“舔住”肌肉层转一圈再退针头内，外面不能有漏出来的。面的小突起与小缺口契合，然后还有就是瘤块一定要完全塞入针2）匀浆法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于PBS 等体系中（以下均以 PBS 为例），用剪刀剪开，剔出中心的坏

17、死部分，以及外表的包膜（如果比较明显的话），清洗干净，然后换到 干净的 PBS 中，用剪刀剪成 1mn 直径左右的小块，然后用玻璃匀浆器 匀浆，注意上下 次数不可超过 5 次，匀浆时可以适当的旋转， 200 目 筛网过滤，然后取滤液用台盼兰活细胞计数， 根据计数结果进行稀释， 最后将 组织悬液用注射器接种。 最终的稀释量， 需要根据你瘤株情况 确定的接种量 而定， 这个接种量经过一段时间的稳定后， 可以根据经 验（匀浆液的浓度、 粘度、肿瘤组织大小等情况）直接进行稀释，不 需要计数，但是在早期，还是 建议进行计数后再稀释。另外各种瘤株 的情况不一样， 不光是接种量不同， 同样大小的瘤源匀浆后的

18、活细胞 数也会不同。比如 NCI-H460 匀浆后的活细胞 数就比较多，而 A431 几 乎没有活细胞。另外，如果一个瘤源不够， 可以取多 个瘤源进行接种，般来说，插块法，一个瘤源接种 30 只动物是没有问题的，匀浆法般 2 只也可以接种 30 只 了，为保险起见可以多预备一只瘤源。 注 意考 虑可能需要剔出不合格瘤源的情况。最好不用带血清的培养液代替 PBS 因为血清是异种蛋白，虽然裸鼠 T 细胞缺陷，但是 B 细胞和 NK 细胞完整，含血清的物质会引起 裸鼠的免疫 反应， 连带着接种的瘤组织也会被影响， 降低成瘤率和生 长速度 3 从成瘤效果来说，无血清培养基 P BSsaline 3肿瘤

19、模型体内传代的标准是，肿瘤体积大于500mm3以上就可以了，最好小于1000mm3接种的动物数应该大于实际试验所需动物数，出瘤后要分组给药 的时候淘汰 掉未长出的、 太大以及太小的肿瘤3 然后再根据肿瘤体积 随机分组33. 关于观测指标 可以在出瘤后测量瘤体积，但是主要还是考察瘤重3第三类是以P38& L1210为代表的白血病模型。宿主为DBA2也有人用C57与DBA2的F1代传代，DBA2用于试验，但实际两种宿主传代并没有 什么区别3它们能形成腹水，一般不用于皮下接种试验，平 时多用腹水传代， 实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存时间3也是接种后第二天开始给药腹水都是血性的。另外，腹水量也不多，有的时候可以先注射一到两毫升的PBS后，再抽取。