大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定

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1、陈羽迪 2012332870002 12 生物制药(1 )大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定实验报告一、实验目的1掌握蒽醌苷元的提取方法双相酸水解法。2. 掌握梯度PH萃取法提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及操作方法。3掌握羟基蒽醌类化合物的颜色反应及薄层色谱鉴别方法。二、实验器材材料及试剂：大黄粗粉、浓硫酸、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、浓盐酸、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、普通滤 纸、薄层层析硅胶板(2.5 cmXlO cm)、广泛PH试纸、剪刀、铅笔、尺子、点样毛细管、样品管 等。仪器：500mL圆底烧瓶、球形冷凝管(30cm)、橡皮管、烧杯、滴管、层析缸(广口瓶)、250mL分液漏

2、斗、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、集热式磁力搅拌器、磁子、循环水式多用真空泵、铁架台等。三、实验原理大黄为蓼科植物,味苦,性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效。其主要成分为为蒽醌化合物， 含量约为3%5%，大部分与葡萄糖结合苷，游离苷元有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、 大黄素甲醚等。其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有0酚羟基，酸性第二；芦荟大黄 素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。根据以上化合物的酸度差异，可 用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。大黄酸R1=HR2=COOH大黄素R1=CH3R2=OH芦荟大黄素R1=CH2OHR2=H大黄素甲醚R1=CH

3、3R2=OCH3大黄酚R1=CH3R2=H1. 提取原理双相酸水解法，为一相为与酸水不相互溶的有机溶剂，另一相为酸水，加热回流水解的方法。由于大 黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在，所以首先要将苷水解成苷元，本实验选用硫酸和乙酸乙酯作 为双相酸水解的溶剂，采用加热回流方法，提取大黄药材中的游离蒽醌类化合物。根据苷元不溶于水，可 溶于乙醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热回流提取过程中，稀硫酸可将蒽醌苷水解成苷元 游离出来的蒽醌苷元随即溶于乙酸乙酯中，从而将蒽醌苷元提取出来。2. 分离原理pH梯度萃取法羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用pH梯度法进行分离。具有羧基或多个B位酚羟基 的蒽

4、醌可溶于5%碳酸氢钠溶液；具有一个B位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸钠溶液，只具有a位酚羟基的 蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。以分离酸度不同的蒽醌苷元。也可利用游离蒽醌的极性不同，采用 硅胶柱色谱法进行分离。（1）大黄中游离蒽醌的酸性强弱顺序大黄酸（一COOH）大黄素（B酚一0H）芦荟大黄素（醇一0H）大黄 素甲醚（一0CH3）大黄酚（CH3）。（2）大黄中游离蒽醌的极性大小顺序 大黄酸大黄素芦荟大黄素大黄素甲醚大黄酚。大黄酚和大黄 素甲醚酸性相近，但极性不同，可用硅胶柱色谱法进行分离。四、实验流程大黄粗粉 50g药渣大黄素的提取、分离流程图20%H2SO4 100 ml乙酸乙酯250m 1,

5、水浴回流2h,稍冷过滤乙酸乙酯提取液水洗至中性5%NaIICO3 萃取 |碱水层乙酸乙酯层HC15%Na2CO3大黄酸沉淀（粗品）水层乙酸乙酯层HC1大黄素沉淀（粗品） 水层0.25% NaOH 萃取 3 次HC1芦荟大黄素乙酸乙酯层5% NaOH萃取3次大黄酚、大黄素甲醚沉淀（混合物）乙酸乙酯层五、实验步骤与方法2总蒽醌苷元的提取大黄粗粉50g，置500ml烧瓶中，加20%硫酸溶液100ml和乙酸乙酯250ml,水浴回流提取2个h (加 磁子搅拌)，放置，冷后过滤，残渣弃去，乙酸乙酯提取液置分液漏斗中，分出酸水层，乙酸乙酯提取液用 蒸馏水洗2次(每次20ml)，将乙酸乙酯液放置在锥形瓶中，密

6、封。3. 游离蒽醌的分离与精制(1) 大黄酸的分离和精制将乙酸乙酯提取液置500m 1分液漏斗中，用5%NaHC03溶液萃取三次(80ml, 60ml, 40ml)，合并碱 液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节ph=2，放置，待沉淀析出完全后，过滤，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈 中性，60C干燥，得深褐色粉末，主为大黄酸。沉淀干燥后，样品加冰醋酸10ml加热溶解，趁热过滤，滤 液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针晶为大黄酸。(2) 大黄素的分离和精制经NaHCO3溶液提取过的乙酸乙酯液，继用5%Na2CO3溶液萃取三次，每次用量40ml,合并碱液，在搅 拌下滴加浓盐酸，调节ph=2,析出棕

7、黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀物至洗出液呈中性，60C干燥，沉淀经干 燥后，用15ml丙酮热溶，趁热过滤，滤液静置，析出橙色针晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。(3) 芦荟大黄素，大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离经Na2C03提取过的乙酸乙酯液，再用5%NaOH溶液提取三次，每次用量40ml,合并后的碱液同(1) 法处理，所得产品为黄色粉末，为芦荟大黄素、大黄酚和大黄素6甲醚的混合物。3. 游离蒽醌类化合物的鉴定(1)化学鉴定 碱液试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，加lml乙醇溶解，加10%氢氧化钠溶液数滴，观察 颜色变化。羟基蒽醌类应呈红色。 醋酸镁试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，

8、各加乙醇lml使溶解，滴加0. 5%醋酸镁乙醇溶 液，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。(2)色谱鉴定薄层色谱鉴定吸附剂：硅胶GCMCNa板。样 品：上述分别获得的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚的三氯甲烷溶液及各相 应对照品的三氯甲烷溶液。展开剂：石油醚乙酸乙酯醋酸（2：1：0.2）。展开方式：上行展开。显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏或喷5醋 酸镁甲醇溶液，斑点 显红色。实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算Rf值。六、实验现象大黄粉回流过滤后得黑色残渣和黑色溶液。除去酸水层，水洗有机层，水洗前pHl2，四次水洗后的 pH分别是pH34

9、、pH56、pH67。水洗后慢慢分层，上层溶液为黑色，下层橙红色并含有少量杂质。然 后用5%的NaHCO3溶液萃取3次。上层为黑色溶液，中间有灰绿色的乳化层，下层是橙黄色溶液。加入少许 2%NaCl溶液后中间的乳化层慢慢减少。碱水层加浓HCl时有大量气泡产生，静置溶液中出现少许黄色结晶， 再调pH至23，得大黄酸。乙酸乙酯层用5%的Na2CO3溶液萃取3次。上层为深褐色溶液，含有杂质，中间 有乳化层，下层黑色溶液。得到的碱水层调节pH=2，静置后得黑色溶液并有少量黑絮状沉淀。抽滤得黑色 结晶，为大黄素。乙酸乙酯层用0.25%的NaOH溶液萃取3次。上层为灰黑色，中间有乳化层，下层为黑色 溶液。

10、得到的碱水层调节pH=2,静置后得黑色溶液并有少量黑絮状沉淀。沉淀过滤得黑色沉淀，为芦荟大 黄素。再用5%的NaOH溶液萃取3次。pH1314得到酒红色溶液，没有分层现象。过滤得深褐色沉淀物，进 行硅胶柱色谱。硅胶柱颜色是渐变的，由上到下依次是深褐色、橙色、黄色，收集到亮黄色液体。进行色谱鉴定。 化学鉴定（用标准液）：碱液试验结果：大黄素标准液由亮黄变为粉红，大黄酸标准液、大黄酚标准液、芦荟大黄素标准液 都由亮黄变为橙红。醋酸镁试验结果：大黄素标准液由亮黄变为粉红，大黄酸标准液、大黄酚标准液、芦荟大黄素标准液都由亮黄变为橙红。七、数据记录、结果讨论与分析：数据：经测量得原点到展开剂边缘为6.3

11、cmRf 值的计算：Rf大黄素=Rf(3.6+4.5+5.3)/36.3=0.71 (收集了三瓶50ml大黄素溶液，取平均值)Rf标准大黄素=4.456.3=0.72Rf芦荟大黄素=5.0/5.3=0.79Rf标准芦荟大黄素=3.76.3=0.59Rf大黄素甲醚=6.2/5.3=1.69Rf标准大黄素甲醚=5.2/6.3=0.82Rf 大黄酚=5.25/6.3=0.83Rf标准大黄酚=4.9/6.3=0.78Rf 标准大黄酸=4.0/6.3=0.63讨论：1. Rf与Rf标准大黄素甲醚数据偏差较大。可能是大黄素甲醚的分离不彻底造成的，也有可能是层析中点样 的问题。2. 酸性强弱：大黄酸大黄素芦荟大黄素大黄酚大黄素甲醚3. 注意事项：(1) 游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。(2) 要注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。(3) 萃取时容易发生乳化，而且随着碱液碱度的增高，乳化现象会越严重，所以要轻轻振摇。(4) 每次加碱液进行pH梯度萃取时，注意要测一下乙酸乙酯液的pH。(5) 萃取时一定要注意乳化层的分出，不要混入。4. 羟基蒽醌类遇到碱会变红，因此当pH调节至碱性时，溶液变为酒红色。也可用此性质来鉴别羟基蒽 醌。5. 由于是浓缩液的沉淀，大黄素沉淀和芦荟大黄素沉淀不呈橙黄色，而呈黑色。