WB试验常见问题解答

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1、WB试验常见问题解答 - 1 各位朋友：请教关于SDS-PAGE的问题。 我的配胶体系如下： 15%别离胶 4%浓缩胶 水 2.3ml 2.7ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67ml Tris-HCL PH8.8 2.5ml PH6.8 0.5ml 10%SDS 0.1ml 0.04ml 10%APS 0.1ml 0.04ml TEMED 0.004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd，浓缩胶60V,40min，别离胶90V，70min。跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因？我的试剂都是新配置的。谢谢！ 答：【1】胶的配制方法； 配制不同体积15%胶 SDS-PAGE别

2、离胶所需各成分的体积(毫升) 15%胶 (毫升) ： 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 ： 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 5.0 30?r-Bis(29:1)： 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 25.0 1M Tris, pH8.8： 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS ：0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵： 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED： 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 配制不同体积4%胶 SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(

3、毫升) 4浓缩胶两块胶，5ml 超纯水 ： 3.16ml 40Acr/Bic37.5：1 ： 0.5ml 0.5 mol/L Tris?HClpH6.8 ： 1.26ml 10SDS ： 50 微升? 微升?10%AP过硫酸胺 ： 25 TEMED ： 5 微升? 加TEMED后，立即混匀即可灌胶。 【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比拟重要。假如玻璃板洗不干净，很容易造成楼主所说的现象。 【3】注意电泳液不要出问题是否过期了，是否把转移液当成电泳液了？，电泳液假如出问题，也会造成楼主所说的现象。 2 pvdf膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ？ 我转过很屡次了，都没有看到过丽春

4、红显色。但是有看到有人说能染上，是在是不知道，请教给位大大了 答：【1】PVDF膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人根本上用 的都是PVDF膜，染膜用的都是丽春红。大多数时候都能染出条带的。 【2】下面是丽春红的配方： 10X丽春红染液 丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml 使用时将其稀释10倍。 当然如今有很多公司直接卖配好的丽春红，因为其可以回收重复利用，所以可以买配好的丽春红。下面是一份丽春红的说明书： 1.将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，摇动3-5分钟或更长时间，直至出现明晰条带。对结果作适当 记录。 2.用蒸馏

5、水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，进展后续的Western检测。 从使用说明中，我们可以看出，PVDF膜是可以用丽春红染色的。 【3】我的染色方法是：转膜完成后，取出膜在甲醇里泡1分钟，然后在双蒸水中过一下，放入丽春红里染色，室温，摇床上，时间是530分钟。然后把染好的膜放到双蒸水中洗一下，不要洗的太久，把外表的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看到红色的蛋白条带了。然后把膜放在TBST中，室温，摇床上洗3次，每次10分钟。然后就可以往下做了。 【4】丽春红的染色敏感性和ECL敏感性差的很远呢。也就是说，及时丽春红染色染不出来，ECL 也有可能曝光曝出来的。 【5】

6、感觉丽春红染色效果不是很好的，有时候清楚，有时候也不是很清楚。而且染色后再往下做后面的结果会收到一定的影响。所以，假如纯熟了，后面就可以不染色了。也可以上样的时候都上两个孔的样，转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色，假如染上了，说明其他的也会染上的。 3 我做WB，曾跑出过条带，就是有非特异性条带，准备摸一抗和二抗浓度，但后来就什么条带都显不出来了，就算换成有条带时的浓度，条件也没变，就是做不出来，转膜后膜上能明晰看见预染的彩虹marker，但用丽春红染膜，却没明显的蛋白条带，就能看见泳道，请教实验室其它人，就说是我转膜弥散，求助个位大侠，我该怎么做？ 说说我的wb条件：蛋白大小：50kd 5积

7、层胶，10别离胶 电泳先100v，后180v 转膜条件：冰水中恒压100v 1h 湿转在转时电流在200400ma变，先小，后大，还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡，我用的是NC膜，滤纸两边个四层 答：【1】转膜的时候最好用衡流，试一下380毫安，半小时。转移液注意最好现配先用，不要用很屡次，这很重要，我一般应用不超过两次。 【2】转膜的时候，夹胶和膜的夹子的松紧要适中，可以通过调节滤纸的张数来控制夹子的松紧。 【3】电泳的电压太大，减小电泳的电压。可以先用80伏20分钟，然后120伏。也可以一直用80伏。也可以先用60伏，然后80伏。 【4】可以适当增加曝光时间试一下。 4目的蛋白不表达。

8、的leilaliu wrote: 这是我的操作步骤：取0.1g 组织，加1ml裂解液1 mol/l tris.hcl 2.5ml ,NaCl 0.438g, TritonX-100 0.5ml, 蒸馏水至50ml，使用时加了100ug/ml的PMSF)，机械匀浆2分钟，冰上裂解30分钟，然后14000g 10分钟离心，取上清液。取20ug上样量，然后80V浓缩胶，130V别离胶，然后80V，180mA转膜2个小时，然后5%封闭一个小时，室温。然后一抗1：5005%脱脂奶粉加TBST里面孵育一个晚上，TBST清洗3次，每次10分钟。然后二抗1：2000处理方式同一抗，孵育时间为1个小时，室温，T

9、BST清洗3次，每次10分钟。再用ECL 处理等等。 但是，我的目的蛋白：CaMKIIa总是做不出来。狂哭。分子量是50KD。 答：【1】上样量一般是20100微克，你的上样量是20微克，你的条带很弱或者出不来，为什么不加大上样量呢？可以加到100微克左右呀这点其实挺重要的。 【2】你说：“80V，180mA转膜2个小时”。一般转膜的时候只能衡流或者衡压吧，怎么你的电流电压都是恒定的呢？转膜感觉还是衡流好。我一般用380毫安湿转30分钟。当然转膜很多条件都是可以的。 【3】一抗孵育最好在摇床上，一抗孵育后，TBST清洗3次，每次5分钟就可以了。 【4】可以适当增加曝光时间。蛋白不 的蛋【打飞人

10、头儿就可打破 5 各位好，我如今遇到的问题是，立春红显色后效果很好师姐和实验教师都这么认为，虽然不知道蛋白条带45KD的详细位置，但是比对Marker还是可以感觉到那局部的条带很明晰的。但是我始终做不出结果，现把步棸详解如下，希望大家帮我分析p 一下： 1，封闭5的脱脂奶粉一小时，室温下摇床上进展。 2，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。 3，孵育一抗cell signaling，单克隆抗体，比例是1:1000(说明书上标示)。先室温摇床上1小时，再放在4度冰箱过夜。 4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。 5，孵育二抗博士德，比例是1：5000我用的说明书上的最大

11、标示。室温摇床2小时。 6，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。 7，参加pierce显色试剂按说明书要求进展。 8，曝光5分钟，显影至今为出现目的条带，定影。把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。 答：【1】细节决定成败！ 【2】你说你的显色液都是荧光了。我估计你每次做完了，显色用的器具都不洗吧？其实很多人都不在意，这点其实很重要的，就是但凡和膜接触的东西都要干净，要洗的很干净，当然夹膜用的镊子更是要干净。 【3】整个显色曝光都应该在暗室里呀。你放外面显色干什么呀？这是一个连续的过程，没必要分开吧，感觉分开反而跟浪

12、费时间呀。 【4】详细问题详细分析p 。显色的时间不是固定的，假如膜放到显色液里，荧光很强，迅速拿出，放到保鲜膜上，然后曝光就可以了。假如膜放到显色液里，荧光很弱，可以多放一会，其实不用放很长时间也是可以的。可以把膜放到保鲜膜上，因为保鲜膜上会粘有显色液的，在保鲜膜上照样可以进展显色反响的。假如膜很亮就是说荧光很强，曝光时间可以很短的，假如荧光很弱或者看不到荧光，可以曝光很长时间的。假如荧光很强，我会曝光最短的时间，也就是说，把曝光盒压片暗盒盖上然后用最快的速度翻开就可以了，假如荧光弱的话，我就用黑塑料袋把曝光盒装起来然后放入抽屉，去吃饭或者干其他事情，回来继续显影定影，条带照样很清楚的，哈，

13、有时候那是相当的清楚。 【5】我把你的步骤改了一下。供参考。 1，封闭5的脱脂奶粉4小时，室温下摇床上进展。说明：封闭是很重要的一步，这步应该多话时间。一般来说，2小时也可以的，但是1小时有些短了。 2。此步删掉。 3，孵育一抗cell signaling，单克隆抗体，一抗用5的脱脂奶粉稀释，比例是1:1000(说明书上标示)。放在4度冰箱过夜。一抗孵育不是时间越长越好，应该适度，假如越长越好，那直接在室温或者在37度放一夜不是更好。一抗用5的脱脂奶粉稀释效果远好于用TBST等稀释，这是我的亲身经历。封闭过后不用洗脱。 4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟，摇床上。可以不用滤纸吸，直接放入二抗孵

14、育。 5，孵育二抗博士德，比例是1：5000我用的说明书上的最大标示。室温摇床1小时二抗1小时足够了。 6，TBS/T洗膜3次，每次10分钟。可以不用滤纸吸。 7，参加pierce显色试剂按说明书要求进展。 8，曝光5分钟曝光时间可以按实际情况的不同而不同，显影至今为出现目的条带，定影。把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。 6 本人在做一个18KD蛋白的wb，转膜后预染marker各个条带都可见，不知道就是目的条带都不能曝光出来。内参的B-actin条带明晰，背景也没有。 想请教各位大侠： 1.胞浆蛋白的提取是不是有什么特殊要

15、求。有什么提取方法比拟好！ 2.18kd蛋白的转膜甲醇的浓度是不是要比拟高。 3.其他。 希望可以有好的答复，最好能提供好的【参考文献】：p 。谢谢！ 答：【1】你转膜后预染marker各个条带都可见，说明转膜没有问题。 【2】感觉还是用试剂盒好一些。 【3】可以适当减少电泳的时间。 【4】测过蛋白浓度吗？蛋白浓度是多少呀？假如蛋白浓度不是很高，上样量不是很大的话，可以增加上样量，增加蛋白浓度。 【5】增加一抗浓度，增加一抗孵育时间。 【6】增加显色时间。 【7】增加曝光时间，可以曝光很长时间的。 【8】当然是0.2m的膜好一些，但是18KD的蛋白用0.45的膜也可以的。注意转膜时间不要太长。

16、 7请问有人做过19KD的蛋白吗？已经做了一段时间了，可是还是没有什么起色啊。如今跑胶倒是已经可以了。但是转膜后染色看不到我要的条带啊。那条带在胶上就是很淡的，但是根本能看到。可是转膜后就真的什么都看不到了似的。有没有什么方法可以成功将量少的蛋白条带转膜啊可以肯定的说我的转膜条件没有将我所需要的条带转过。谢谢了。 答：【1】没有问题，继续往下做就可以了。 【2】很多人都在考马斯兰染色的胶上或者在丽春红染色的膜上找自己的目的条带，看到一个条带就说是自己的目的条带。其实真的是自己的目的条带的可能性很小。组织蛋白或者细胞蛋白中含有很多种蛋白的，所以碰巧是目的蛋白的可能性是很小的尽管从预染MARKER知道分子量是相近的。我们染胶或者染膜的目的并不是看自己的目的蛋白是否在胶上或者是否转到了膜上。而是看胶上是否有蛋白，是否有比拟清楚的蛋白条带。染膜就是看蛋白是否转到了膜上。通过整体的蛋白的情况来推测自己的目的蛋白的情况。并不是非要找出自己的目的蛋白。 【3】要知道ECL的敏感性要比丽春红强很多的，也就是说比丽春红敏感很多倍的，染色染不出的蛋白，显色或者曝光照样可以出条带的。 【4】你的膜上都看到了蛋白，说明整体上还是可以的，可以继续往下做。 第 11 页 共 11 页