分子克隆简答题

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1、简述基因克隆的两个基本特征？基因克隆的两个基本特征是一是强调外源核酸分子(一般情况下都是DNA)在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的一个重要特征，基因操作的另一个重要特征是繁殖。如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。在原核生物中，基因及其产物是共线性的。70年代以来，在真核生物中，发现了间断基因，后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就是后来所说的基因间存在着内含子。内含子指真核生物基因中不能被翻

2、译成蛋白质的DNA片断，但可被转录，当两侧序列的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录物中除去。外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。内含子并不是一成不变的，具有相对性，对一个DNA片断来说，在某个基因中是内含子，但在另一个基因中却可以作为外显子。什么是genecloning?什么是亚克隆(subcloning)?基因克隆：一定程度上等同于基因的分离，即从复杂的生物体基因组中，经过酶切，消化等步骤，分离带有目的基因的DNA片段。基因亚克隆：初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中

3、不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。假如从一个原核生物中cloning某基因(l-2kb),请谈谈它的基本步骤？对原核生物染色体DNA进行不完全酶切，纯化所得到的DNA片断，并与载体连接，转化大肠杆菌；得到转化子后，根据目标基因两侧的已知序列设计探针，杂交，筛选转化子；所得到的转化子中含有目标基因，进一步作亚克隆，一步步地向目标基因逼近，最后可得到目标基因什么叫基因工程(GeneEngineering)，试从理论和技术两个方面谈谈GeneEngineering诞生的基础？基因工程(GeneEngineering)又称基因操作(GeneManipulat

4、ion)、重组DNA。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原先的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。思考题问题：简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。思考题问题：为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？思考题问题：简述基因的结构组成对基因操作的影响。简述限制性内切核酸酶(Restrietionendonuclease)的概念及其生物学功能？定义：指识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。生物学

5、功能：保护宿主不受外来DNA分子的感染，可降解外来的DNA分子，从而阻止其复制和整合到细胞中。PCR引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加34个碱基。试回答影响限制性内切核酸酶(Restrictionendonuclease)切割效率的因素？外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象在酶切缓冲液中，一般需加入BSA,请问加入BSA的作用是什么？并

6、简述其原理？作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用。限制性内切酶在稀释液中会迅速变性，BSA是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。何谓Staractivity?简述Staractivity的影响因素及克服方法？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活性的的因素：高甘油浓度（5%）；酶过量（100U/ml）；低离子强度（25mM）；高pH（8.0）；有机溶剂如PMSD（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）和sulphalane等；用其

7、它二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替Mg2+。星星活性的抑制措施：减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；提高离子强度到100150mM（在不抑制酶活性的前提下）；降低反应pH至7.0；使用Mg2+作为二价阳离子。某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？生物体内的DNA序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化的限制酶DpnI来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的情况。天然的质粒载体（plasmidvectors）通常

8、需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，弓I入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。将产生的5突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点；同尾末端的连接，不同的同尾酶切割DNA产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失；平末端的连接双脱氧终止法测定DNA序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知识测定较长片段的DNA序列？将所需要测序的DNA片断采用2种不同的限制性内切酶切割，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的DNA序列；用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与载体连接后，

9、测序，拼接，即可得到全长DNA片断。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的酶切片断能覆盖所需测序的DNA片断。大肠杆菌DNA聚合酶I,具有35外切活性和53的聚合酶活性以及53的外切活性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途?利用E.coliDNA聚合酶的5-3外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA，所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应；用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性；对3突出端的DNA作末端标记（交换或置换反应）。用T4phageDNApolymerase可进行末端标记，试简述其原理？T4phageDNA聚合酶具有3-5外切活

10、性和5-3的聚合酶活性，3-5的外切活性可以被5-3的聚合活性所封闭，首先在反应体系中加入一种dNTP，产生3凹端，然后加入经过标记的dNTP，利用T4phageDNA聚合酶的聚合活性补平3凹端，即可得到标记了末端的DNA片断。BAP和CIAP有何作用？为何一般采用CIAP而不采用BAP？作用：催化除去DNA或RNA5磷酸。BAP抗性强，抗高温和去污剂。CIAP可用蛋白酶K消化灭活，或在5mMEDTA下，65C处理或75C处理10分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的DNA，从而去除CIAP的活性。相比之下，CIAP比BAP更易去除，因此，一般采用CIAP。依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6

11、噬菌体RNA聚合酶和T4或T7噬菌体RNA聚合酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？将T7RNA聚合酶基因置于E.colilacUV5启动子之下，插入到入噬菌体中，感染E.coli，建立稳定的溶源菌。E.coliBL21（DE3）菌株即为将lacUV5启动子和T7聚合酶基因置于入噬菌体DE3区，该入噬菌体DNA整合于染色体的BL21处。若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中，在IPTG诱导下，可启动外源基因的表达；先导入带T7噬菌体启动子控制的目的基因的质粒，再用入噬菌体（带T7RNA聚合酶基因）感染E.coli，激活目的基因的表达。简述T4多核苷酸激酶的活

12、性和用途？T4多核苷酸激酶的活性催化ATP的Y磷酸基转移到DNA或RNA的5末端。可表现为两种反应，正反应指ATP的Y磷酸基被转移到去磷酸化的DNA5端，用于对缺乏5磷酸的DNA进行磷酸化。在交换反应中，过量的ATP可使该激酶将磷酸化的5端磷酸转移给ADP，然后DNA从【丫32PATP中获得放射性标记的Y磷酸而重新磷酸化，因此可用于DNA的末端标记。用途：该酶主要用于对缺乏5磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。通过交换反应，用于标记5末端，以供MaxamGilbert法测序、S1核酸酶分析以及其它须使用末端标记DNA的步骤。思考题问题：限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有

13、何特点？思考题问题：哪些酶可用于DNA片段的末端标记？思考题问题：DNA聚合酶有哪些类型，各有什么活性？思考题问题：在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？将外源DNA或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选；其它：有一定的拷贝数，便于制备。含pMB1或（ColEl）复制子的plasmid是如何复制的，其调节机制如何？复制方式：在复制时，首先合成前RNAII，即前引物，并与DNA形成杂交体；而后RnaseH切

14、割前RNAII,使之成为成熟的RNAI，并形成三叶草二级结构。该引物引导质粒的复制。调节机制:形成的RNAI可控制RNAII形成二级结构，同时Rop增强RNAI的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNAI和RNAII之间相互作用的突变，将增加带有pMB1或（ColEl）复制子的拷贝数。当向细菌培养基中加入氯霉素时，可以使细菌质粒的拷贝数得到扩增，试分析其原理？pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶I,DNA聚合酶III）,依赖于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的产物。因此，即使存在抑制蛋白质合成并阻

15、断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1（或ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚23千个质粒。抗性基因（Resistantgene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr,neor）以及琥珀突变抑制基因supF。青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。Ampr编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化B-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体30S亚基的

16、一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。Tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。何为a-complement?如何利用a-complement来筛选插入了外源DNA的重组质粒？a-complementation指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的B-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。a-complementation是基于在两个不同的缺陷p半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现a-complement主要有两部分组成：LacZAM15,放在F质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ，放在载体上，作为筛选标记，当在LacZ中插入一

17、个片断后，将不可避免地导致产生无a-complement能力的p半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG和底物X-gal(同时可作为生色剂)的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的p半乳糖苷酶，不能分解X-gal，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。为什么野生型的入噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？参考答案：野生型噬菌体DNA没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的，不能大于基因组的105%，所以要将入噬菌体改造成载体，必须削减分子量；野生型的入噬菌体对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；没有可供选择的标记；野生型的入噬菌体具有感染性，因此不够

18、安全。试简述入噬菌体的Lyticgrowth和Lysogenicstate两种循环的分化及其调节过程？Lyticgrowth是入噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代入噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。Lysogenicstate为入噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化的频率就越高。溶源现象的生化媒介可能是3-5cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长另

19、外一个重要的调节因素是噬菌体的CII蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体DNA整合到细菌的染色体中去。高浓度的CII蛋白促进溶源化，而低浓度的CII蛋白促进裂解生长。当CII蛋白浓度足够时，激活CI蛋白和基因int的表达，导致噬菌体DNA与染色体整合，朝着溶源态生长。用入噬菌体载体进行genecloning时，主要利用入噬菌体的生物学特性作选择标记，其中有cI失活和Spi筛选，请问什么叫cI筛选？什么叫Spi筛选？CI蛋白控制溶源态的形成，裂解生长受到抑制，当外源基因片段插入cI中，cI蛋白失活，溶源态打破而进入裂解生长而筛选出重组克隆，叫做cI筛选。野生型噬菌

20、体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感(sensitivetoP2interference)。如果入噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶源性E.coli中生长良好，噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过入噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组入噬菌体。简述入噬菌体载体的克隆原理及一般步骤？入噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA片断。工作原理：入噬菌体载体克隆外源DNA片断的原理与质粒载体的工作原理是

21、类似的，只是在形式上有许多差别。载体和外源DNA片断经过酶切后，外源DNA片断插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段。这种连接后的重组DNA保留增殖性能，但由于分子量太大，不能象重组质粒DNA那样可通过转化方法进入大肠杆菌。通过提取入噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重组噬菌体DNA进行包装，形成噬菌体颗粒。这样的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，可将被包装的重组噬菌体DNA注射到宿主菌中。通过裂解生长，可增殖重组噬菌体。克隆步骤：通过裂解过程增殖载体；载体与外源DNA的酶切；外源DNA与载体的连接；重组噬菌体的体外包装；包装噬菌体颗粒的感染；筛选。Cosmid的工作原理是什么？粘粒载体的主

22、要原理类似入噬菌体载体。在外源片断与载体连接时，粘粒载体相当于入噬菌体载体的左右臂，cos位点通过粘端退火后，再与外源片断相间连接成多联体。当多联体与入噬菌体包装蛋白混合时，入噬菌体A基因蛋白的terminase功能将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片断包装到入噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组DNA就象入噬菌体DNA一样，被注入细胞并通过cos位点环化。这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。通过这种方式，就将外源DNA片断通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中去了。构建粘

23、粒文库时会遇到哪些问题？你如何解决？利用粘粒构建基因文库时会遇到许多困难：载体分子会自身连接，从而导致效率大大降低甚至失败。通过对载体作去磷酸化处理或使用双cos位点载体或对载体的酶切产物进行部分补平可解决这一问题;多个外源片断插入载体中，会误将两个本来不相连的DNA片断认为是基因组中的连续DNA片断。通过收集3545kb的部分酶切外源DNA片断与载体连接、使用双cos位点载体或对载体和外源片断的酶切产物进行部分补平，可解决这一问题。提取的基因组DNA长度小于200kb，将使部分酶切后形成的3545kb片断只有少部分在其两端带有酶切位点，致使目标DNA的可用性大大降低。在对外源DNA片断作部分

24、酶切之前，应检查其大小，如果小于200kb则不能用于构建文库；提取的总DNA纯度不高，可能由于出现酶解抑制物而得不到理想的酶切产物。因此，在制备总DNA时，应小心避免混入的有机相和水相交界处的物质。如果问题依旧出现，可用氯化铯梯度离心方法纯化DNA或重新制备总DNA；在构建的文库中常常出现不含外源片断的克隆。这种“空”克隆的比例依载体的不同和操作的小心程度而不同一般而言，使用单cos位点的载体，约有5的克隆是空的。使用双cos位点的载体，产生空克隆的比例要低得多；不同重组质粒拷贝数可以有很大差异，导致收获量相差悬殊。每当对文库作一次噬菌体的扩增，这些差异将会被进一步放大；尽管文库似乎全面，但也

25、许不能获得目的克隆。限制酶位点的非随机分布、包装蛋白污染限制酶、重组引起的序列缺失和扩增时目的克隆可能被淘汰等都是产生这种现象的原因。丝状噬菌体克隆中经常会遇到哪两类问题？可用何种方法来解决？外源DNA区段的部分缺失，克隆于丝状噬菌体基因间隔区的外源基因趋于不稳定。外源基因越大，缺失突变率越高，尽量避免带有让感染细菌在液体培养中连续生长，可以使这种现象减少到最低限度（尽管不能完全消除）。正确的做法是，用保存于一70C的重组噬菌体原种转染适当的宿主菌，铺成平板，并从分隔良好的单个噬斑的中央挑取细菌进行小规模培养；外源DNA总是以单方向插入，实验中经常会遇到，尽管某一载体可能在两个方向上接受DNA

26、，但特定外源DNA区段却更容易仅以其中一个方向插入该载体，这种情况屡见不鲜。之所以出现这种现象，是因为外源DNA另一条链上的序列不同程度地干扰了载体基因间隔区的功能。在多克隆位点区内遴选不同的位点插入外源DNA，或者选用可进行定向克隆的限制酶组合，有时可避免上述问题。噬菌粒（Phagemid）具有那些特征？许多phagemid都有一个主要的缺点，即在辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA的产量较低且重复性一般较差，试分析其原因？双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；免却了将外源DNA片断从质粒亚克隆于噬菌体载体；由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。原因：噬菌体携带的

27、基因间隔区的确切序列，携带完整基因间隔区的质粒可由于干扰辅助病毒DNA复制而抑制子代噬菌体颗粒的产生；基因间隔区插入质粒的具体位置，基因间隔区插入pBR322Hindlll位点所构成的噬菌粒，会严重干扰野生型噬菌体的生长,而将基因间隔区插入Ahalll位点则不然；辅助噬菌体的性质，野生型丝状噬菌体及其抗干扰突变株都被用作辅助噬菌体。辅助噬菌体基因间隔区插入了lacZ序列，因而基因II产物对它的识别不那么有效；克隆于噬菌粒的外源DNA的大小与性质，因外源DNA片断的大小而异，单链DNA的产量可以在510倍之间有所差异(一般来说，外源DNA越大，产量越低)。另外，由于一些尚不清楚的原因，大小相同的

28、外源DNA，其单链DNA的产量也参差不齐。YAC载体具有什么样的功能性元件？为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和粘粒办不到的。大片断的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时减少完整基因组文库所需的克隆数目。思考题问题：作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？思考题问题：何为a-互补？在载体构建中有何作用？思考题问题：请简要描述?噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式，及其在构建载体中的作用。思考题问题：简述M13K07辅助噬菌体

29、的遗传学特性和生物学功能，及其在制备单链DNA中的作用。分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好，其分辨力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。琼脂

30、糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素？DNA的分子大小，分子越大，则摩擦阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢；琼脂糖浓度，一个给定大小的线状DNA片断，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同；DNA分子的构象；电源电压，在低电压下，线状DNA片断的迁移速率与所加电压成正比。但是，随着分子量的增加，高分子量DNA片断的迁移率将以不同的幅度增长。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小；电场方向；碱基组成和温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。CsCl-EB梯度平衡离心法分离质粒和染色体DNA的原理？CsCl是一种高分子量的重金属，在一定的高速离心下，可以自

31、动形成CsCl的浓度梯度；当进行离心时，CsCl溶液中的大分子物质将根据它本身的密度停留在不同的CsCl密度区，形成一个致密带，而不会像CsCl一样形成浓度梯度。CsCl溶液中大分子到底在何处形成带，将取决于大分子本身的浮力密度。DNA的浮力密度大约为1.7g/cm3，离心时将迁移到CsCl的密度为1.7g/cm3处。与此相反，蛋白质的浮力密度相当低，将漂浮在离心管的顶部。而RNA则沉淀于离心管的底部；溴化乙碇存在的密度梯度离心中，能够将超螺旋的DNA与非超螺旋的DNA分离开来。嗅化乙碇可嵌入到DNA的双螺旋分子中，使DNA部分解旋，其结果可使线性DNA的浮力密度减少0.125g/cm3。由于

32、超螺旋的DNA没有游离的末端，解螺旋的幅度有限，也就只能结合有限的EB，因此，超螺旋DNA的浮力密度只有少许下降，大约为0.085g/cm3。结果，超螺旋的DNA将与线性、开环的DNA在EBCsCl密度梯度离心中由于密度不同而分开。小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？加solutionI前，没有用STE洗涤，导致细菌菌株的细胞壁成分抑制限制酶的活性；没有用酚：氯仿抽提蛋白，导致DNA能耐受限制酶酶切；限制酶对甲基化敏感，而所采用的宿主为非甲基化缺陷型，可采用对甲基化不敏感的同裂酶，或换用甲基化缺陷型的宿主菌株。何谓RNA的斑点杂交和狭缝杂交？将DNA或

33、RNA样品直接点在固体支持物上，然后与核酸探针进行分子杂交，这种方法称为斑点杂交。如果借用一种模具，将核酸样品加到模具的狭缝中，通过真空抽滤，印迹到滤膜上，然后进行杂交称为狭缝杂交。以pUC18系列为载体，外源基因经酶切和载体连接后，将其导入处于感受态的宿主细胞中，筛选菌落，设计一个实验证明外源基因能在宿主细胞中转录表达。实验步骤：将该基因克隆到一个表达载体上，利用表达载体本身的启动子，大量表达目标蛋白；目标蛋白纯化，制备抗体；将该抗体与宿主细胞进行杂交，若出现信号，则说明该基因在该宿主细胞中能转录表达，否则，不能转录表达。简述随机引物标记的原理和步骤？随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡

34、聚核苷酸片段群体，含有各种可能的排列顺序(46=4096)；或是用DNA酶处理小牛胸腺DNA后获得的612个碱基的片段。将待标记的DNA片段同随机引物一起进行杂交，并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物，在Klenow酶的作用下合成互补DNA链，当反应底物中有放射性底物dNTP时，新合成的DNA就带上了标记。何谓S1核酸酶作图？有何应用？S1核酸酶作图指：预先判断mRNA的端点位置，设计一段覆盖该端点的寡核苷酸，并作末端放射性标记。然后将该标记的寡核苷酸与mRNA混合，退火，形成杂交体。在S1核酸酶作用下，呈单链状态的DNA和RNA被降解，保留DNA-RNA杂交体双链，最后通过凝胶电泳检测DNA-RN

35、A杂交体中标记的DNA单链的分子量大小，从而推断mRNA的末端序列。什么是Westernblot？它和Southernblot有何区别？Westernblot是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后利用特异性抗体进行检测。它与Southernblot的不同在于探针的性质不同，在Westernblot中所使用的探针是抗体(蛋白质)，而Southernblot的探针则是核酸。思考题问题：在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？思考题问题：印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。思考题问题：核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？思考题问题：DNA转化

36、有哪些方法，各有何优点？PCR技术的原理是什么？从大的方面讲，PCR技术可用于哪些领域？PCR技术是一种DNA扩增技术。它通过温度的变化使得双链DNA解链、退火、延伸。通过多次这样的循环，模板DNA就可以按几何级数速度扩增。应用于分子生物学和基因工程及其他与DNA鉴定相关的领域。Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；产物不能形成二级结构；引物长度一般在1530碱基之间；G+C含量在40%60%之间；碱基要随机分布；引物自身不能有连续4个碱基的互补；引物之间不能

37、有连续4个碱基的互补；引物5端可以修饰；引物3端不可修饰；引物3端要避开密码子的第3位。在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应(Plateaueffect),请问什么叫Plateaueffect？产生Plateaueffect的原因有哪些？平台效应是指在PCR反应后期，产物的积累按减弱的指数速率增大(一般已积累到0.3lpmol产物)。原因为可能为：底物浓度降低；dNTP或酶稳定性降低；末端产物抑制；非特异性竞争；特异性产物自身变性等。在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，

38、那又是为什么？PCR扩增有时出现拖带或非特异性扩增条带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，模板中杂质过多，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多等引起。如果检测结果看不到DNA带或DNA带很弱可能是：模板中含有杂质；酶失活；引物质量不好；Mg2+浓度过低；反应体积的改变等等；其他的一些物理原因，如复性温度低，变性时间短等或者也可能是由于靶序列的变异等。通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？首先，将特异性蛋白进行转膜，然后进行氨基末端测序，依据测序结果设计探针从该植物的cDNA文库中筛选

39、阳性克隆(如果没有cDNA文库可以先做cDNA文库)；最后进行亚克隆，将目标片段转入表达载体上进行表达分析。由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？RT-PCR技术是实现由mRNA起始扩增出DNA的一种实验方法。RT-PCR是将RNA模板的反转录(ReverseTranscription)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先是以RNA为模板，在反转录酶的作用下得到cDNA，然后以cDNA为模板进行聚合酶链式扩增从而得到目标DNA。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录

40、产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。思考题问题：如何理解PCR扩增的原理和过程？思考题问题：通过PCR技术扩增已知序列侧翼的未知序列的关键问题是什么？用PCR作染色体步查有何特点？思考题问题：PCR产物的克隆与一般的DNA片段的克隆有何异同点？思考题问题：为什么在定量PCR中要引入Ct值的概念？用双脱氧终止法测定DNA序列时，为何一般需制备M13克隆载体而不直接采用双链DNA？利用M13克隆载体可以得到单链DNA，方便测序。简述随机测序的基本原理？原理：将待测DNA克隆于噬菌体载体(M13)上，然后通过一定手段将待测DNA片断化，得到两端彼此重叠的部位不同

41、的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。得到一段未知功能的基因序列，如何对它进行分析？基因信息的序列分析。例如，两种序列的比较；基因编码领域，启动子或增强子序列的预测；蛋白质序列的氨基酸顺序的确定；新基因的发现，通过分析EST(ExpressedSequenceTag)序列结合DNAChip技术寻找新基因；基因多型性分析，分析基因多型性特别是SNP(SingleNucleotidePolymorphi)，发现并定位功能性基因，作为人类群体进化，或者疾病关联标记；高级结构的预测，根据测序所得到的核酸一级结构的信息，可以预测核酸和蛋白质的二级结构及其三级结构，

42、从而预测其功能。根据测序所得到的核酸一级结构的信息，可以预测核酸和蛋白质的二级结构及其三级结构，从而预测其功能。何谓测序酶？与Klenow片段相比，它有何优点？测序酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。与Klenow聚合酶相比，该酶的3-5外切活性完全缺失。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如dITP和7-脱氮一dGTP等用于提高分辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸具有广泛的耐受性。它是测定长段DNA序列的首选酶。以下为某一DNA序列，据此回答下列问题5-GATCTAAATTCTAGCCTTGAACTCATACGGGATTGTTAAATCTAG-33-CTAGA

43、TTTAAGATCGGAACTTGA-GTATGCCCTAAGAATTTAGATC-5（1）在DNA测序中，引物设计的基本原理是什么？（2）如果你打算扩增上图所示的一段序列之间的DNA，你会如何选择引物？引物选择的原则：长度：至少16bp，通常为18-30bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性；引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5C。对于小于20个碱基的引物，其Tm值可用简易公式计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）。对于14-70个核苷酸的引物可用以下公式计算。Tm=81.5+16.6（lgK+）+0.41（G+C）%-（675/N）N表示引物的核苷酸数

44、目，K+表示单价离子即钾离子的浓度；避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。G+C含量：尽量控制在40%60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌吟或嘧啶的连续排列，以及T在3末端的重复排列；引物的3末端最好是G或C，但不要GC连排。（2）5-GATCTAAATTCTAGCCTTGAACT-3；5-CTAGATTTAAGAATCCCGTATG-3思考题问题：简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。思考题问题：简述将Sanger的测序方法称为双脱氧链终止法的理由。思考题问题：采用循环测序法测序时引物的设计有什么要求？为什么

45、？思考题问题：现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？思考题问题：设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？什么叫标记获救现象？70年代初0X174DNA（ssDNA5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象，即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。由此可利用突变的DNA片段将突变引入到野生型DNA中。单核苷酸置换插入或缺失中，引物设计的要求？5端完全配对，使得上游（引

46、物）起始的DNA合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需810bp。3端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果错配核苷酸太靠近3端，3端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以3端需有79bp完全配对。为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般1719bp，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。思考题问题：DNA诱变有哪些种类，各有何特点？思考题问题：什么叫有性PCR?有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？思考题问题：简述Kunkel定点诱变基本原理。什么是Genelibrary？它与cDNAlibrary有何区别？由大量的

47、含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。cDNA文库：若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，他们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库简述以质粒为载体构建Genelibrary的基本步骤？总DNA的提取；载体的制备、纯化；基因组DNA的不完全消化；载体与外源DNA片断的连接；转化受体菌，然后在有选择压力的平板上培养转化了外源基因的受体菌;重组子的鉴定；外源DNA进行分析。采

48、用同聚物加尾的方法进行dscDNA克隆，一般采用dC/dG而不采用dA/dT，简述其原因？AT加尾的方法很少用于cDNA克隆，这主要是因为找不到满意的方法可将通过AT加尾而插入质粒中的cDNA切下来；文献中（Hofstetter等，1976）介绍的方法效果不佳，且重复性通常较差。于是，多年以来，几乎所有cDNA克隆都应用GC加尾的方法来进行：将dC残基加到双链cDNA上而将互补的dG残基加到用PstI消化的质粒载体上，切割后留下3突出端，为同聚物加尾的理想底物。克隆cDNA常见的问题？cDNA第一链太短或产量太低，尽管这些问题可能出自用于cDNA第一链合成的任一组分，但在更多情况下，它们反映出

49、用作模板的mRNA的低劣质量；文库中cDNA插入片段的长度小于期望值，该问题一般归于以下两个原因a.cDNA第二链的合成效率不足，以致产生带缺口或带痕量mRNA的双链cDNA分子；b.小片段DNA污染最终的cDNA制剂。cDNA插入片段中NotI、SalI或EcoRI的位点数多于期望值；cDNA插入片段内EcoRI位点的出现频率低于每4kb出现1个位点，该问题归咎于双链cDNA内EcoRI位点的甲基化不完全；用适当限制酶消化久噬菌体载体时切割不出cDNA片断，该问题几乎总是由于合成接头未能有效地连接到双链cDNA末端而造成。如何使用Methylase对克隆DNA进行保护？此步骤有什么意义？在构

50、建基因文库时，可用于接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片断回收。经典RACE克隆的原理是什么？有何意义？在cDNA两端设计两对嵌套引物(5-端GSP1-GSP2和3-端QI-QO),进行两次PCR扩增，第一次以GSP1和QO进行特异扩增，第二次以GSP2和QI为对应引物进行扩增而获得3端和5端的序列。经典RACE的意义在于克服了cDNA克隆常出现的丢失末端

51、序列的现象。简述差别杂交的原理和基本思路？原理：用含目的基因的细胞群体总mRNA和不含目的基因的细胞群体总mRNA作探针，都对用含目的基因的细胞群体总mRNA反转录的cDNA与载体连接构成的cDNA进行平行杂交，比较他们的杂交结果挑出含目的基因的克隆。思路：两种不同的细胞群体，一种细胞群体中的目的基因正常表达，在另一细胞群体中目的基因不表达；制备两种不同群体的总mRNA；以含目的基因的mRNA群体构建cDNA文库；两种不同群体的总mRNA作探针与cDNA文库杂交，比较杂交结果并对照原平板，选出含目的基因的克隆。如何从原核生物中克隆复制子？载体的抽提(该载体无复制子或复制子被切除)及酶切；将所需

52、要研究的外源DNA进行不完全消化；将经过不完全消化的外源DNA片断连接到载体的多克隆位点;在抗性平板上能生长的质粒即为含有复制子的目标片段，可用此方法进一步将复制子定位。苏云金芽胞杆菌的基因组大小为5X106bp，若p=99%，平均克隆片段为lOOkb，计算构建这样一个完全的基因文库所需的克隆数。n=ln(1-p)/ln(1-f)n:个完全基因文库所包含的重组体克隆数p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f:插入片断的平均大小与基因组DNA大小的比值根据以上公式可得到所需要的克隆数为228思考题问题：基因组DNA文库有哪些类型?其相关的特点是什么？思考题问题：构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题？思考题问题：均一化cDNA文库构建的基本原理是什么？思考题问题：扣除cDNA文库的基本原理是什么?主要用途是什么？思考题问题：全长cDNA文库的构建的原理和基本类型是什么？思考题问题：基因克隆筛选的几种方法和相关的技术特征有哪些？