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1、免疫荧光实验iPSC-derive神经元的体外神经毒性检测 如今神经毒性检测主要是依赖活体动物实验，不仅有伦理问题，而且通常非常昂贵并且十分 耗时。当需要大规模的测试化合物的时候就不太合适了。因此，高通量的体外的神经毒性测 试就显得十分必要了，而且可以使用人源的细胞直接进行试验，试验结果的实用性也更佳。 但是，到目前为止，人源干细胞诱导的神经元并没有适合进行这类试验的特质，试验时间较 长，批次间差异大，并且有收到伦理和一些法律的制约，使得这种细胞都不太适用于做大规 模的体外测试试验。最近，市面上出现了商用的人源 iPSC-derive 神经元细胞，重复性好， 可以用来做这类的体外神经毒性试验。
2、荷兰的科学家使用人源 iPSC-derive 神经元细胞做了免疫荧光染色试验，作为高通量进行体 外的神经细胞毒性检测的预试验。由不同供应商提供的人源 iPSC-derive 神经元细胞混合培 养能够形成不同(激活型或抑制型)神经元共培养的样本。ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons? Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kast
3、eel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.一、实验材料1) 细胞： iCell Neurons(NRC-100-010-001，Cellular Dynamics international) CDI iCell Astrocytes(Cellular Dynamics international)HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)DOPA.4U neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)2) 培养基:Complete iCell Neurons Maintenance Medium
4、 (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 p g/mL)3) 试剂: Poly-L-Ornithine (PLO 0.01%)4)培养耗材:口-Slide 8孔腔室载玻片，ibiTreat底部处理(ibidi， Germany， 80826)、实验方法)载玻片包被 每孔加入 300p l 的 0.01%的 Poly-L-Ornithine 溶液 室温孵育60 分钟 吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟，即可开始使用 )免疫荧光实验1）铺细胞：iCell Neurons 每孔铺 1000
5、00 个细胞iCell Neurons/CDI iCell Astrocytes 共培养，每孔铺 66000 个细胞HIP neurons 每孔铺100000个细胞DOPA.4U neurons 每孔铺 52000 个细胞DOPA.4U neurons/iCell Astrocytes 共培养，每孔铺 48000 个细胞2）加入约300p 1/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，静置15分钟3）加入300p l 1% Triton X-100的PBS溶液通透3-5分钟4）加入300p l 2% BSA的PBS溶液封闭20分钟5）依次加入一抗，二抗进行免疫荧光染色后，冲洗小室并加入封片液进行显微镜观察
6、（图 二）。图二：图示铺细胞，固定，清洗，染色步骤。三、实验结果DIV 14- |3(|l|)Tubulin/DIV8-P(MI)Tubulin /DJV14- p(lll)Tubwiin/DIVS-vGAl/ /| DOPA.4U-astrocYte co-ciiltureiCell Neuron-astrocyte co-cultureHIP heurons图三：iPSC-derive神经元的免疫荧光染色结果。不同种类的人源iPSC-derive神经元使用0 （lll）tubulin （绿色）和GFAP （红色），用来区分神经元和星型胶质细胞（HIP neurons,左上； DOPA.4U neurons，左下；iCell neurons，右上。）Human iCell 神经元用 vGAT （绿色）和 vGluT （红色）确定抑制或激活突触（右下）。细胞核使用 DAPl 染色（蓝色）。
免疫荧光实验
