增殖与组培继代培养

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1、、继代培养1. 培养物 再培养的或从初代培养新生长的组织或器官称为“培养物”。在初代培养的基础上所获得的 培养物如愈伤组织、芽、胚状体和原球茎等，数量都还不太多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从 面发挥快速繁殖的优势。2. 继代培养 把初代培养所获得的培养物，移植到新的培养环境，这种移植操作经过多次反复的培养， 就叫继代培养，又叫连续培养。依移植操作的次数分别称为第 1 次继代培养、第 2 次继代培养 . ，连 续多代的培养又被称为建成培养。其目的旨在繁殖出相当数量的无菌芽（苗）。继代培养的后代是按几何 级数量增加的过程。3. 继代培养中扩繁的方法，包括切割茎段、分离芽丛、分离愈伤组织、分

2、离胚状体、分离原球茎等 切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。增殖使用的培养基对于某一种植物的培养物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环 境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。继代培养是经常性不停的进行过程。在达到相当数量之后，应考虑使其中大部分转入生根阶段。从 某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。二、继代方法1. 固体培养 有利于器官的分化。2. 液体培养 以原球茎或胚状体方式增殖时，如兰花中增殖后得到的原球茎，分切后进行振荡培养（22 C恒温，连续光照）即可获得大

3、量的原球茎，再切成小块转入固体培养基中，即可得到大量小苗。在快速繁殖中，增殖培养有时采用浅层液体静置培养，生根阶段再采用固体培养基，以节省成本。三、提高增殖速度的方法1. 改进培养基历来使用的培养基大多为培养细胞、愈伤组织和根等设计的，无机盐浓度较高，对一些植物茎尖、 芽的生长不一定合适。一方面可参考已有资料或相关的报道，一方面进行多种实验找出最佳培养基。 GR 在 增殖培养中所起的作用往往是决定性的，但是报道差异很大。现将带普遍性的结果总结如下：（1 ）细胞分裂素类通常高浓度会抑制茎芽的发生，如竹节海棠在6-BA2-3mg/L时，几乎不能生 长，至 0.5 mg/L 后能逐渐恢复正常的分化出

4、苗和生长；月季在 6-BA 太高时，茎芽增殖成短密的丛生芽， 生长几乎停止。但是，细胞分裂素的浓度也不能太低，否则没有侧芽出来，会愈伤组织化。无菌短枝型增 殖，因为不存在顶端优势，有时不加细胞分裂素或在 0.1 mg/L 以下也可。但在天南星科植物如万年青、花叶芋、红掌、绿巨人、绿霸王等的组织培养中，愈伤组织的诱导和 丛芽的增殖都需要6-BA2-3 mg/L，甚至5 mg/L的浓度。在香蕉、粉蕉的组织培养中也使用高浓度的 6-BA 。但浓度不宜过高，否则器官分化能力下降，且使遗传变异增加。（2 ）生长素类一般双子叶植物要求较低的浓度，如果浓度高会抑制芽的形成。如NAA使用的 浓度，秋海棠为 0

5、.2mg/L ，菊花 0.2-1mg/L ，月季 0.01-0.2mg/L ，倒挂金钟 0.5-1 。单子叶植物要求的较高，如朱蕉 2,4-D2-3mg/L ，萱草 2,4-D2mg/L ，水仙 NAA15mg/L ，虎尾兰 属植物 NAA6-10mg/L 。（3 ）赤霉素可能参与细胞的增殖，促进芽的形成和生长。在菊属、拟南芥属植物中，加入GA3 可促进芽的分化，因为其内源 GA 3 水平低的缘故；在烟草、秋海棠和水稻的组织培养中，对茎芽的分化 有抑制作用，特别是在类分生组织时期最为明显。如烟草正在分化的愈伤组织在黑暗条件下， GA 3 处理 30-60min ，减少芽的分化， 48hr 后所

6、有的类分生组织或茎芽消失。（ 4 ）脱落酸 ABA 能部分克服烟草中 GA 3 引起的对芽形成的抑制作用，红薯中加入 ABA 能促 进芽的分化，可能是其内源 GAs 超过了阀值。PGR 对器官分化的影响可见图 8-1 的总结。其他培养基组分和附加成分也有影响。如烟草培养中， PO4-3 可以抵消 IAA 对芽的抑制作用，无 论腺嘌呤或 KT 存在与否都能促进器官的分化；水解酪蛋白能提高 KT 诱导芽分化的作用，特别是当 IAA 浓度高时，酪氨酸可代替水解酪蛋白的作用。2. 改善培养条件 见第 章。四、继代培养中分化能力下降的因素及解决措施在植物组织继代培养中，有些植物种类能良好地继代，如马铃薯

7、、非洲紫罗兰、香石竹、菊花和花 叶芋等，而另外一些则不能，如杜鹃、瑞香、大蒜等，分化能力衰退。主要原因及对应措施有：1. 生理原因 培养过程中逐渐消耗了母体中原有与器官形成有关的特殊物质，不同植物保持分化能力 差异很大，如禾本科植物、植物单倍体不易再生，更难保持。对策：加入腺嘌呤或酪蛋白等物质后，器官分化的能力可得到一定的恢复。2. 遗传因素 继代培养中常出现染色体紊乱，特别是器官发生型，继代培养中分化能力的丧失与倍性 不稳定有关。对策：尽量利用丛芽增殖或胚状体增殖的途径，如果要利用器官发生型代数一定要少，并要检查培 养物的倍性情况。3. 植物材料的影响繁殖能力，一般是草本植物木本植物，被子植

8、物裸子植物，年幼树老年树, 刚分离组织已继代组织，胚营养体组织，胚状体芽愈伤组织。4. 培养基及培养条件如 Bhojawani 和 Hayward 发现，在 B5 上培养的小麦愈伤组织只大量地生根而不分化芽，通过在 培养基中附加天门冬酰胺 2000mg/L ，黑暗培养时， 4-6 个月瓶中分化出大量的小苗；水仙鳞片基部再生 子球的继代培养中，加活性炭的再生子球比对照要高出 1- 几倍。桉树继代培养中发现如果总在23 -25 C下培养，芽会逐渐死亡；但如果先在15 C下培养3天, 再转至25 C下则可继代。5. 继代培养的时间长短有的材料经过长期的继代可基本保持原来的再生能力和增殖率，如葡萄、月季、倒挂金钟等。有的经过一定时间继代培养后才能有分化再生能力，如沙枣愈伤组织继代 6 次后才分化出芽。有的随继代培养德望时间加长而分化再生能力下降，如杜鹃在第 4-5 代培养，虽可用光照或提高生 长素浓度可减慢下降的速度，但无法阻止。6. 季节的影响 如球根类植物组织培养繁殖和一些植物胚的培养时，继代不能增殖，可能是其进入休 眠。对策：可通过加入 GA3 、 NAA 或低温处理，如唐菖蒲在 MS 培养基上得到的球茎，转入 1/2MS 上，增加 NAA 用量，可防止继代中的休眠。