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1、非无菌产品微生物限度检查：微 生物计数法 浙江省食品药品检验研究院 郑小玲 计数方法的概况 主要内容 1 计数培养基适用性检查2 供试品计数方法适用性检查3 供试品检查4 结果判断5 计数方法的概况 平皿法 薄膜过滤法 MPN法 有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数 不适用活菌制剂的检查 受控环境洁净环境下的局部洁净度不低于 B级 可采用替代方法 确认方法的适用性 计数方法的概况 细菌数：营养琼脂培养基， 30 35， 3天 霉菌和酵母菌数：玫瑰红 钠琼脂培养基， 20 28， 5天。酵母菌计数：酵母浸出 粉胨葡萄糖琼脂 需氧菌总数（ TAMC)： 胰酪大豆胨琼脂（ TSA）， 胰酪大胨肉汤（
2、 TSB） 30 35， 3 5天 霉菌和酵母菌总数（ TYMC)： 沙氏葡萄糖琼脂培养基， 20 25， 5 7天 修订后 计数培养基适用性检查 菌种及菌液制备 阴性对照 菌种：标准菌株 (CMCC)，传代次数不超过 5代 金葡、 铜绿 、枯草、白念、黑曲 菌液制备：用 pH7.0无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠 溶液制菌悬液。 菌液制备后室温放置， 2小时内使用； 2 8， 24小时内使用。 黑曲霉孢子悬液可保存在 2 8，在验证过的贮存期内使用。 以稀释剂进行阴性对照组，应无菌生长 计数培养基适用性检查 TSA、 TSB、 SDA： 1、实验用菌株： TSA:金葡、铜绿、
3、枯草、白念、黑曲 TSB：金葡、铜绿、枯草 SDA:白念、黑曲 2、接种： TSA、 SDA:涂布法、倾注法。 TSB：直接接入 接种量不大于 100cfu，细菌 30 35培养不超过 3天，真菌 20 25培养不超过 5天。 每一试验菌株平行制备 2管或 2个平皿。 对照培养基替代被检培养基同法操作。 3、 TSA、 SDA与对照培养基比较， 回收率为 50% 200%， 菌落形态 与对照培养基一致。 TSB与对照培养基比较，试验菌应生长良好。 玫瑰红钠培养基、 SDA+抗生素、选择性培养基 计数方法适用性检查 供试液制备 1.液体供试品 2.固体、半固体或黏稠性 供试品 3.需用特殊方法制
4、备供试液 的供试品 （ 1）非水溶性供试品 （ 2）膜剂 （ 3）肠溶及结肠溶制剂 （ 4）气雾剂、喷雾剂 （ 5）贴剂 （ 6）具抑菌活性的供试品 1.水溶性供试品 2.水不溶性非油脂类供试品 3.油脂类供试品 4.需用特殊方法制备供试液的 供试品 （ 1）膜剂 （ 2）肠溶及结肠溶制剂 （ 3）气雾剂、喷雾剂 （ 4）贴膏剂 修订后 如药典上所列方法经确认不适用，可采用其他适宜方法。 计数方法适用性检查 稀释液 1.pH7.0无菌氯化钠 -蛋白胨 缓冲液 2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 （用于肠溶制剂） 3.pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 （用于结肠溶制剂） 1.pH7.0无菌氯化钠 -蛋白胨
5、 缓冲液 2.pH7.2磷酸盐缓冲液 3.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 （用于肠溶制剂） 4.pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 （用于结肠溶制剂） 5.TSB 6.不局限上述稀释液 修订后 计数方法适用性检查 1、总需氧菌计数用 5种菌。 2、菌液加入供试液中，接菌量不大于 100cfu，所加菌液的体积 应不超过供试液体积的 1%。 3、选择最低稀释级的供试液进行试验。 3、培养时间、可接受标准同培养基适用性检查。 接种和稀释 试验组 菌液对照组 供试品对照组 稀释剂对照组 ？ 计数方法适用性检查 抗菌活性的去除或灭活 1、增加稀释液或培养基体积 . 2、加入适宜的中和剂或灭活剂。 3、采用薄膜过滤法
6、。 4、上述几种方法的联合使用。 若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失 败，表明供试品对该试验菌具有抗菌活性，同时也表明供试品不 可能被该类微生物污染。但是，供试品也可能仅对特定试验菌株 具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品 须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判 断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行 计数方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释 级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查。 计数方法适用性检查 供试品中微生物的回收 1、平皿法：每株试验菌每种培养基至少制备 2个平皿。 倾注法 、涂布法
7、 2、薄膜过滤法：孔径不大于 0.45 m,直径为 50mm,若采用 其他直径的滤膜 ,冲洗量应进行相应的调整。 每张滤膜每次冲洗量为 100ml，总冲洗量不得超过 1000ml。 3、 MPN法：不适用于霉菌计数。 若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求, 那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。 供试品检查 1、检验量：另有规定外 ,一般供试品的检验量为 10g或 10ml；膜剂 为 100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时 ,应从 2个以上最小包装单位中抽取供试品 ,大蜜丸还不得少于 4丸 , 膜剂还不得少于 4片。 2、供试品的检查：需
8、氧菌总数（ TSA)、霉菌和酵母菌总数 (SDA） 3、阴性对照试验：以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，应无 菌生长。如果有菌生长，应进行偏差调查。 4、实验方法：平皿法：每 稀释级 每种培养基至少制备 2个平皿。 薄膜过滤法 MPN 结果判断 需氧菌总数是指TSA上生长的总菌落数（包括真菌 菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养 基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡 萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结 果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉 素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或选择性培养 基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测 定。使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。 若采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。 结果判断 各品种项下规定的微生物限度标准解释如下： 10 1 cfu： 可接受的最大菌数为20； 10 2 cfu： 可接受的最大菌数为200； 10 3 cfu： 可接受的最大菌数为2000：依此类推。 Thank you！ 计数方法的概况 平皿法：包括倾注法和涂布法。该项下明确可 使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增 加。
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