无菌检验及方法验证.pdf

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1、无菌试验及验证无菌试验及验证 无菌试验及验证 孙冬梅 孙冬梅 无菌检查 定义 背景 培训 设施 无菌试验室的清洁 环境检测 方法验证 无菌检查 结果 解释和重新测试 调查报告 定义 营养实验( 灵敏度检查): 证明培养基能够 growth promotion test 支持微生物生长 阴性控制 : 用来鉴定假阳性 negative controls 阳性控制 : 用来鉴定假阴性 positive controls 背景 局限性 检出的可能性小，不能检出病毒 /支原体，破坏性, GMP的要求 在微生物回收率最佳的条件下进行该实验以减少方法的局限性. 是无菌产品质量标准中的一项 不能证明整批产品的

2、无菌性 , 但可以证明产品非无菌 实际工作中，没有微生物在培养基中生长 ,只能判定此批产品在 此试验条件下是无菌的；培养基变混浊意味着产品被污染 如何保证产品无菌？ 经过验证的恰当的生产工艺或无菌工艺 培训 在进行无菌测试前，操作人员必须熟练无菌操 作，经过专门的培训并通过资格认证 . 确保每次实验操作人员都遵循 SOP进行操作并 接受监测。 定期对操作人员进行培训。特别 对经常出现无菌实验假阳性、阴性控制出现阳 性的操作人员 保留培训记录 设施 洁净室设计 无菌更衣室和气闸 洁净室的表面和内部设施 洁净室设计 达到无菌生产时相应洁净室级别的要求 设备根据相应的要求经过确认（ IQ/OQ) 无

3、菌检查应在环境洁净度10000 级背景下的局部 100级的单向流 空气区域内或隔离系统内进行 无菌检查应在足够大的区域内进行， 物品的放置不会破坏层流 每年至少对层流台或隔离器进行一次确认 洁净室的空气应通过高效过滤器，如果压差超出范围应该能看到、 听到报警 不同级区的压差不小于 12.5帕斯卡。 压差记录 /经过验证的计算机检测系统 每次实验前检查压差 压差表上标明压差的范围 更衣室 进入无菌室前更换无菌衣（符合进入生 产区无菌区的更衣要求） 在不影响无菌更衣程序的条件下，设计 应方便人员从非洁净室进入洁净室. 如长 凳 配备穿衣镜，更衣说明，洗手池，洗手 液，干手机，无菌衣存储架 无菌更衣

4、 无菌更衣，头套，鞋套，护目镜，口罩 每次进入更换新的无菌服 保留无菌衣灭菌记录 实验员需得到无菌更衣的培训和资格确认，并保留记 录 洁净室设备和表面 电源插座，日光灯应嵌入墙或天花板内并密封 好，避免非洁净空气进入。洁净室表面应光滑 并耐腐蚀 转角光滑，容易清洁 应有通讯设备并便于消毒 应设有椅子和放置物品的桌面或推车，并便于 消毒 不应存放与实验无关的物品 紫外灯 无菌实验室的清洁 实验过程中操作表面和操作人员要经常用消毒剂消毒 双手 要有无菌实验室的清洁程序SOP 隔离器有其独特的消毒方法 在清洁前确保所使用的清洁剂,消毒剂经过验证, 最少 接触时间和灭菌效力. 所选择的消毒剂应达到使用

5、要求 至少两种消毒剂轮换使用 保留清洁剂消毒剂的配制记录,有相应的SOP 环境监测 环境监测应结合空气和表面取样方法 ,如 - 空气浮游菌监测 ; - 沉降碟 ; - 表面监测 :接触碟或擦拭法 ; - 空气粒子数检测 - 操作员的无菌衣和双手 . 对环境中分离出的细菌进行鉴定 ,可以帮助解释无菌实验结果 环境监测应在动态条件下进行 取样点 , 暴露时间, 监测频率都应有相应的 SOP 规定, 并应设置警戒 限度和行动限度 选择合适的培养基, 接触碟培养基需要含有中和剂 微生物实验方法验证的目的 验证实验 :抑真菌 /抑细菌实验 在对一个产品进行无菌测试之前， 要确认 产品固有的活性不会影响测

6、试的可靠性， 并证明所用的测试程序适合于该产品的无 菌测试。 进行无菌测试验证时，所用测试方法应与 正常测试相同。 若样品的组分或原检验条件发生改变时， 测试方法需重新验证。 方法验证实验 方法验证实验（续） 通过阳性微生物在不同条件下的生长对比实验,证明: -在检验前样品的预处理能有效的抵消/ 中和产品的抑菌 性 -样品的预处理方式和检验过程及培养条件等均不会影 响样品中固有微生物的生长 如果知道产品对某种菌存在抑制,则将该菌作为阳性菌, 寻找克服抑制的实验条件,再用其他阳性菌进行检查 对三个批次的产品进行验证 细菌培养3天，真菌培养5天 与阳性对照比较，含供试品的容器中实验菌生长良好。 否

7、则验证无效。 方法验证实验（续） 薄膜过滤法 将规定量的样品按薄膜过滤法过滤，冲洗， 在最后一次冲洗液中加入小 100cfu 试验菌。取出滤膜转移至相应的培养基中， 或将培养基加入滤筒内。取另一装有相同体 积的培养基的容器加入等量的试验菌，作为 阳性对照。按规定温度、时间培养。 讨论：菌液的加入 方法验证实验（续） 直接接种法 取适量的培养基，分别加入试验菌，每 瓶加试验菌10-100cfu，每种菌加2瓶， 其中一瓶加入规定量的供试品，另一瓶 作为阳性对照。按规定温度、时间培养 方法验证实验（续） 结果判断 如果接种后的培养基和阳性对照相比有明显 的微生物生长迹象，则说明该产品无抑菌活性 或该

8、活性已被削减到满意的程度，无菌测试程 序可以不加修改直接使用。 如果加过产品并接种后的培养基和阳性对照相 比生长微弱、缓慢或不生长，则说明该产品的 抑菌活性在该测试条件下没有被减弱到满意的 程度，需要对测试条件进行修改并重新验证至 该产品的抑菌活性被削减到满意的程度 方法验证实验（续） 采用一种或更多的方案对无菌测试方法进行修改，重新进行验 证。每个修改方案都必须很好地存档。只需用首次验证时未出现 生长的测试菌株，如果该菌株在修改后的测试条件下可以生长， 则在 同等条件下对所有的测试菌株进行验证。如果修改方法不 能使所有的测试菌株都出现生长，则 采用那个使最多种测试菌 株出现生长的方法。 薄膜

9、过滤法可采用的修改方案 : 增加淋洗液、培养基的用量。 用其他成分的滤膜而不用纤维素成分的滤膜 ( 如聚偏二氟乙烯， 尼龙，聚四氟乙烯或聚炭酸酯 )。 在淋洗液中加入表面活性剂 (如淋洗液 K) 来分散产品中的乳化粒 子。为了提高产品的可溶性，可将淋洗液保温到 35C 45C。 如可行的话，在淋洗液中加入一合适的无菌的生物去活物质。 无菌实验 取样Sampling 检测方法Test methodology 培养基Media 培养时间Incubation period 阴性对照Negative test controls 阳性对照Positive test controls 取样 取样要有代表性

10、,如开始 ,中间, 结束 如果无菌实验无效, 进行再次实验的样品要能反映最初 样品的特性,取样点或无菌工艺过程的干扰 检验方法 薄膜过滤法是首选的方法 建议首先润湿滤膜（对小体积的产品和 抗生素必须先润湿滤膜） 用方法验证时验证的最少冲洗量的冲洗 液来冲洗滤膜。 每张滤膜过滤的体积不要超过1000ml 检验方法（续） 试验经验 样品表面 /穿刺部位的消毒 物料的进入，过滤器盒的消毒 无菌操作注意 手和操作表面的消毒 蠕动泵的流速 空气过滤器的保护 培养基 中国药典 : 改良马丁和 FTM 美国药典 : TSB 和FTM 购买的 RTU培养基 /实验室配制的培养基 按照相应的SOP 编制培养基的

11、批号 培养基质量控制（ pH，无菌性，灵敏度实验） 制定有效期 FTM培养结束后培养基氧化层（粉红色）不应超过培养基深度 1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过 20分 钟），迅速冷却，只限加热一次 培养基（续） 灵敏度检查 根据药典方法选择阳性菌种 (G-,G+,酵母菌 ,真菌 , 环境中分离 得到的菌株) 购买的 RTU培养基每批要进行灵敏度检查 将小于 100 CFU的阳性菌加入培养基内, 计数 细菌培养不超过 3天, 真菌培养不超过 5天 空白对照无菌生长, 加菌的培养基生长良好 加入添加剂的培养基须重新进行灵敏

12、度检查 菌种制备 ,保存和培养的SOP 对新开的菌种冻干管需要对菌种进行鉴定 ,菌种传代不超过 5 代 培养基（续） 灵敏度检查 购买药典推荐的菌种 FTM：枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌，生 孢梭菌 TSB：白色念珠球菌，黑曲霉菌 -至少包含一种环境菌 培养基无菌性检查 培养基应在适当的温度下培养 14天以检测其无菌性 ,每批随机抽取 5瓶 -培养基灵敏度检查可以和培养基无菌性检查、无菌检查同步进行 无菌检验 检验数量: 是指一次实验所用供试品最小包装容器的数 量（样品无菌检查） 检验量: 是指一次实验所用的供试品总量（验证实验， 阳性对照） 培养基用量: 除另有规定外,应不小于

13、药典规定的量 阳性对照: 检验实验操作是否按照方法验证的程序进行, 对实验的检验 阴性对照: 对实验条件,操作人员无菌操作,淋洗液无菌 性的检验 检验规程 Microsoft Word 文档 无菌检验 COA of Millipore 无菌检验 隔离器内的无菌测试装置 无菌检验 标准无菌测试漏斗 新的无菌测试漏斗 无菌检验 封闭式无菌检测系统的安装 无菌检验 样品检测 无菌检验 加注培养基 培养 培养 培养时间 培养 14天 培养温度 :CP 真菌 23-28度, 细菌 30-35度 USP真菌 20-25度, 细菌 30-35度 记录培养箱的温度 ,每年校验培养箱的温度 定期清洁培养箱 培养

14、记录，培养期间每天检查样品 ,并记录 培养基产生悬浮、絮凝、沉淀， 14天后将 2-5 培养物转入新鲜的培养基内，再培养 7天 阴性对照 阴性对照：在进行无菌检测时 ,没有样品的漏斗作为阴 性对照 需记录和计算阴性对照发生的频率 阳性对照 阳性对照：在进行无菌试验时将含样品的滤筒 内加入阳性控制菌 阳性菌的选择 阳性对照要与无菌检查分室进行 各国药典/法规对阳性对照的要求： EP， USP，TGA CP 结果判断 培养基澄清或虽然显混浊但经证明并非有菌生长 -供 试品符合规定 任何培养基显混浊并确认有菌生长 -供试品不符合规 定 除非证明生长的微生物非产品固有 当满足下列至少一个条件时,判断试

15、验结果无效 a) 无菌测试实验室微生物监测数据超标 b) 检查时发现无菌测试过程有误 c) 阴性对照发现污染 d) 污染菌鉴定明确表明污染是由于无菌测试所用材料及实验 技术造成 结果的解释 如果无菌测试被认为是无效的，用同样数量的 样品进行复试。 如果复试没有出现微生物生长迹象，产品通过 无菌测试。如果复试仍出现微生物生长迹象， 产品无菌实验失败。 定期对无菌测试结果和阴性对照进行趋势分析 调查报告 无菌试验失败需起草调查报告 调查包括：细菌鉴定；环境/人员检测结 果；灭菌记录；人员资格；检验方法； 粒子计数结果；无菌室清洁记录；层流 台过滤器完整性等 产品放行前完成调查 保存归档 谢谢大家！ 谢谢大家！