第六章生物酶工程

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1、Enzyme EngineeringEnzyme Engineering 第六章第六章 生物酶工程生物酶工程 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达一、酶基因的克隆一、酶基因的克隆在体外将各种来源的目的酶基因与载体连接形成具有自我复在体外将各种来源的目的酶基因与载体连接形成具有自我复制能力的制能力的DNADNA分子，即重组载体，然后通过转化或转染等分子，即重组载体，然后通过转化或转染等方式将重组载体导入宿主细胞并培养，筛选出含有目的基因方式将重组载体导入宿主细胞并培养，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增

2、、提取，从而获得大量所需酶基的转化子细胞，再进行扩增、提取，从而获得大量所需酶基因。因。Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达DNADNA重组技术的发现重组技术的发现19721972年，世界上第一个重组年，世界上第一个重组DNADNA分子诞生分子诞生19801980年，获诺贝尔化学奖年，获诺贝尔化学奖Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达（一）酶基因克隆的主要操作步骤（一）酶基因克隆的主要操作步骤1.1.目的基因的分离获取目的基

3、因的分离获取2.2.载体的选择与准备载体的选择与准备3.3.目的基因与载体连接目的基因与载体连接4.4.重组基因转入受体细胞重组基因转入受体细胞5.5.重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达1.1.目的基因的获取目的基因的获取PCRPCR待扩增目的基因两端序列已知（据此设计引物）待扩增目的基因两端序列已知（据此设计引物）基因文库基因文库先构建，再筛选先构建

4、，再筛选化学合成法化学合成法直接合成目的直接合成目的DNADNA（序列已知、片段较短）（序列已知、片段较短）cDNAcDNA文库文库Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达基因文库（基因文库（genomic librarygenomic library）构建）构建Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达2.2.克隆载体的选择克隆载体的选择载体：携带外源载体：携带外源DNADNA，实现外源，实现外源DNADNA在受体细胞的无性在受体细

5、胞的无性繁繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子分子分类：分类：按功能按功能克隆载体（用于获得目的克隆载体（用于获得目的DNADNA片段）片段）表达载体（获得目的表达载体（获得目的DNADNA片段所编码蛋白质片段所编码蛋白质)按基本元件来源按基本元件来源质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 黏粒载体黏粒载体 病毒载体病毒载体 人工染色体载体等人工染色体载体等Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达目的目的DNADNA的大小及受体细胞的种类和来源的大小及受体细胞的

6、种类和来源Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达理想克隆载体的要求：理想克隆载体的要求：是一个独立的复制子，有复制起始序列，可在宿主细胞中独立自是一个独立的复制子，有复制起始序列，可在宿主细胞中独立自主复制主复制 DNA DNA上有若干合适的限制性核酸内切酶位点，便于外源上有若干合适的限制性核酸内切酶位点，便于外源DNADNA的的插入插入有易被识别筛选的标志基因有易被识别筛选的标志基因 安全，不含对受体细胞有害的基因安全，不含对受体细胞有害的基因Enzyme EngineeringEnzyme Engineer

7、ing第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达3.3.目的基因与载体连接目的基因与载体连接 用用T T4 4或或E.coliE.coli DNA DNA连接酶可连接互补黏性末端连接酶可连接互补黏性末端 用用T T4 4 DNA DNA连接酶连接平端连接酶连接平端 先在先在DNADNA片段末端加入人工接头，形成黏性末端再进行连接片段末端加入人工接头，形成黏性末端再进行连接Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达4.4.重组载体导入受体细胞重组载体导入受体细胞 导入原核受体细胞方法：氯化钙法、电穿孔法、转导

8、等导入原核受体细胞方法：氯化钙法、电穿孔法、转导等导入真核受体细胞方法：导入真核受体细胞方法：酵母细胞：原生质体转化法酵母细胞：原生质体转化法动物细胞：电穿孔法、微量注射法动物细胞：电穿孔法、微量注射法植物细胞：植物细胞：T Tii 质粒转化法、基因枪法质粒转化法、基因枪法Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一

9、节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达5.5.重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 根据载体的选择标志初步筛选（比如抗生素抗性、蓝白斑筛选等根据载体的选择标志初步筛选（比如抗生素抗性、蓝白斑筛选等)PCR PCR 法法 核酸杂交法核酸杂交法 免疫学方法免疫学方法放射性免疫法和酶联免疫法放射性免疫法和酶联免疫法 DNA DNA限制性内切酶图谱分析法限制性内切酶图谱分析法 核苷酸序列测定法核苷酸序列测定法Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达二、酶基因的异源表达二、酶基因的异源表达（一）外源基因在原核细胞中的表达

10、（一）外源基因在原核细胞中的表达1.1.原核生物基因表达系统的特点原核生物基因表达系统的特点大肠杆菌大肠杆菌 只有一种只有一种RNARNA聚合酶聚合酶 表达以操纵子为单位表达以操纵子为单位 转录与翻译偶联转录与翻译偶联 不含内含子，缺乏内含子切除系统不含内含子，缺乏内含子切除系统 表达调控在转录水平表达调控在转录水平 mRNAmRNA上含有上含有SDSD序列序列Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克

11、隆和表达2.2.影响原核生物基因表达系统表达效率的因素影响原核生物基因表达系统表达效率的因素启动子结构（强启动子比如大肠杆菌启动子结构（强启动子比如大肠杆菌lacPlacP、trpPtrpP，人工构建的，人工构建的tacPtacP等）等）转译起始序列（转译起始序列（SDSD序列的保守性、序列的保守性、SDSD序列后面的序列后面的4 4个碱基成分以个碱基成分以及起始密码子及起始密码子AUGAUG左侧的密码子的碱基组成都会影响到外源基因的左侧的密码子的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率）表达效率）启动子同克隆基因间距离（由于启动子同克隆基因间距离（由于mRNAmRNA的的5 5端形成不同的二级结

12、端形成不同的二级结构，影响构，影响mRNAmRNA的翻译效率）的翻译效率）质粒拷贝数及稳定性（增加相应的质粒拷贝数及稳定性（增加相应的mRNAmRNA分子数量）；分子数量）；还还有，宿主对目标基因密码子的偏好、细胞的代谢负荷及表达蛋白质有，宿主对目标基因密码子的偏好、细胞的代谢负荷及表达蛋白质的稳定性、表达条件等因素的稳定性、表达条件等因素Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达是不是所有基因都可以在是不是所有基因都可以在E.coliE.coli中表达？中表达？必要条件：必要条件：删除内含子和删除内含子和5 5非

13、编码区非编码区需要强启动子和需要强启动子和SDSD序列序列维持正确开放阅读框维持正确开放阅读框mRNAmRNA稳定，形成的蛋白质不被降解稳定，形成的蛋白质不被降解蛋白不需翻译后加工蛋白不需翻译后加工Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达（二）外源基因在真核细胞中的表达（二）外源基因在真核细胞中的表达Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达1.1.酵母表达系统酵母表达系统大肠杆菌大肠杆菌/酵母穿梭载体：通常在原核细胞中用于克隆基因，

14、在真核酵母穿梭载体：通常在原核细胞中用于克隆基因，在真核细胞中用于基因表达分析细胞中用于基因表达分析 原核质粒序列原核质粒序列复制起始序列和抗药性基因标记复制起始序列和抗药性基因标记 在真核细胞中表达重组基因所需元件在真核细胞中表达重组基因所需元件启动子、增强子、转录终启动子、增强子、转录终止子和加止子和加polyApolyA信号序列、信号序列、mRNAmRNA剪接信号序列、标志基因、单一剪接信号序列、标志基因、单一限制性内切酶位点限制性内切酶位点Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达2.2.昆虫表达系统昆虫表

15、达系统载体：昆虫病毒（如昆虫杆状病毒），穿梭载体（在细菌和昆虫细载体：昆虫病毒（如昆虫杆状病毒），穿梭载体（在细菌和昆虫细胞间穿梭）胞间穿梭）同同源源重重组组Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达优点：优点：可对蛋白质进行翻译后加工修饰可对蛋白质进行翻译后加工修饰可高水平表达外源基因产物可高水平表达外源基因产物操作相对简单（已经商品化）操作相对简单（已经商品化）蛋白准确定位（如分泌到胞外）蛋白准确定位（如分泌到胞外）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克

16、隆和表达酶基因的克隆和表达 3.3.哺乳动物表达系统哺乳动物表达系统载体：载体：哺乳动物细胞质粒表达载体，动物病毒哺乳动物细胞质粒表达载体，动物病毒特点：特点：表达最接近天然的重组蛋白质表达最接近天然的重组蛋白质重组蛋白的产量较低重组蛋白的产量较低直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能可用于基因治疗可用于基因治疗Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第一节第一节 酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造一、酶的定点突变一、酶的

17、定点突变 定点突变是指在基因的特定位点引入突变，即通过取代、定点突变是指在基因的特定位点引入突变，即通过取代、插入或删除已知插入或删除已知DNADNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，以此来改善酶的蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，以此来改善酶的特性特性Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造（一）寡核苷酸引物突变（一）寡核苷酸引物突变 通过聚合酶的作用启动通过聚合酶的作用启动DNADNA分子进行复制，用含有特定核苷酸改变分子进行复制，用含有特定核苷酸改变（突变）的

18、寡核苷酸片段作为引物合成（突变）的寡核苷酸片段作为引物合成DNADNA子链的其它部分子链的其它部分基本步骤：基本步骤：将待突变基因克隆到突变载体上将待突变基因克隆到突变载体上 制备含有待突变基因得单链模板制备含有待突变基因得单链模板 突变寡核酸引物与待突变基因的核苷酸形成一小段碱基错配突变寡核酸引物与待突变基因的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的异源双链DNADNA 合成突变基因；合成突变基因；转化和筛选。转化和筛选。特点：保真度高，操作复杂特点：保真度高，操作复杂Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造（二）（二）PCR

19、 PCR 突变突变 55553355553355553333模板 D N A引物 A引物 AP C R 1P C R 1P C R 2P C R 2P C R 3P C R 4引物 B引物 C引物 B 和 C混 合 、变 性、退 火重组重组PCRPCR定点突变示意图定点突变示意图Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造555335355333模板 D N A引物 AP C R 1P C R 2引物 B5355引物 C大引物大引物PCRPCR定点突变示意图定点突变示意图Enzyme EngineeringEnzyme Engi

20、neering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造（三）（三）盒式突变盒式突变 利用一段人工合成的含有点基因利用一段人工合成的含有点基因 突变的双链寡核苷酸片段，直接突变的双链寡核苷酸片段，直接 取代野生型基因中的相应序列，取代野生型基因中的相应序列，从而获得突变基因从而获得突变基因特点：简单易行，突变效率高，可特点：简单易行，突变效率高，可 以在限制酶切位点内进行一次突变以在限制酶切位点内进行一次突变 而获得多个突变位点。但靶而获得多个突变位点。但靶DNADNA区段区段 两侧必须存在一对限制酶单切位点两侧必须存在一对限制酶单切位点。Enzyme EngineeringEnzyme Engi

21、neering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造(四四)QuikChangeQuikChange 点突变试剂盒点突变试剂盒 近年来，分子生物学研究工具和产品研发的领先品牌近年来，分子生物学研究工具和产品研发的领先品牌StratageneStratagene，将其在酶工程领域内的卓越贡献引伸到高效突变技术的改进方面，将其在酶工程领域内的卓越贡献引伸到高效突变技术的改进方面，不断推出基于不断推出基于QuikChangeQuikChange方法的优质产品。截止目前，方法的优质产品。截止目前，QuikChangeQuikChange定点突变技术一直被公认为是最值得信赖、最高效定点突变技术一直被公认

22、为是最值得信赖、最高效和最好用的突变方法，为分子生物学研究节约了大量的时间和其它和最好用的突变方法，为分子生物学研究节约了大量的时间和其它的宝贵资源。的宝贵资源。Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造优点：优点：同时进行多达同时进行多达5 5个点突变个点突变采用高保真采用高保真PfuTurbo DNAPfuTurbo DNA聚合酶，确保扩增过程的高准确性，聚合酶，确保扩增过程的高准确性，无预期外的随机突变错误无预期

23、外的随机突变错误快速简单的快速简单的3 3步操作，一天内完成步操作，一天内完成 每个突变位点使用一个带突变的寡核苷酸引物，节省引物费用每个突变位点使用一个带突变的寡核苷酸引物，节省引物费用可使用简并寡核苷酸引物可使用简并寡核苷酸引物含有高转化效率的含有高转化效率的XL-10 Gold XL-10 Gold 超级感受态细胞超级感受态细胞Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造二、酶的定向进化二、酶的定向进化模拟天然酶的自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，产生基因模拟天然酶的自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，产生基因多样性

24、，再通过定向筛选（选择）获取具有特定性质的突变酶的过多样性，再通过定向筛选（选择）获取具有特定性质的突变酶的过程或技术，称为酶的定向进化程或技术，称为酶的定向进化定向进化定向进化 =随机突变随机突变 +定向选择定向选择Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造（一）（一）酶分子定向进化的基本方法酶分子定向进化的基本方法酶定向进化的基本步骤：酶定向进化的基本步骤：通过随机突变和体外重组创造基因多样性；通过随机突变和体外重组创造基因多样性；导入适当载体构建突变文库；导入适当载体构建突变文库；通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。通过

25、灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造 1.1.易错易错PCRPCR 通过使用低保真度的通过使用低保真度的TaqTaqDNADNA聚合酶或改变聚合酶或改变PCRPCR常规反应条件，如常规反应条件，如调整反应体系中四种调整反应体系中四种dNTPdNTP的浓度（增加突变频率）、增加的浓度（增加突变频率）、增加MgMg2+2+的的浓度（以稳定非互补的碱基对）、添加浓度（以稳定非互补的碱基对

26、）、添加MnMn2+2+（降低聚合酶对模板的（降低聚合酶对模板的特异性）等，引起碱基以某一频率产生随机错配而引入多点突变，特异性）等，引起碱基以某一频率产生随机错配而引入多点突变，构建突变库，筛选所需突变体。构建突变库，筛选所需突变体。特点：特点：能够控制突变频率能够控制突变频率缺乏重组机制，核苷酸序列分布的多样性不够缺乏重组机制，核苷酸序列分布的多样性不够Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造2.DNA2.DNA改组改组 从正突变基因库中分离出所需的从正突变基因库中分离出所需的DNADNA片段，利用片段，利用DNaseD

27、Nase或超声波或超声波进行切割产生随机大小进行切割产生随机大小DNADNA片段，得到的随机片段在不加引物的多片段，得到的随机片段在不加引物的多次次PCRPCR循环中，彼此之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为循环中，彼此之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为接近目的基因长度的接近目的基因长度的DNADNA分子，然后再利用基因两端序列为引物扩分子，然后再利用基因两端序列为引物扩增获得全长基因，这是来自不同基因的片段之间的重组。增获得全长基因，这是来自不同基因的片段之间的重组。Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造 特点

28、：特点：DNADNA片段得以重新组合，能在片段得以重新组合，能在较短较短的时间内获得性能明显的时间内获得性能明显改善的酶蛋白，同时可使酶的两个或更多的已优化性质合为一体。改善的酶蛋白，同时可使酶的两个或更多的已优化性质合为一体。Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造3.3.随机引物体外重组法随机引物体外重组法 以单链以单链DNADNA为模板，利用一套随机序列引物进行为模板，利用一套随机序列引物进行PCRPCR扩增，就可以扩增，就可以产生大量和模板不同位点互补的短片段。由于碱基的错配和错误引产生大量和模板不同位点互补的短片段

29、。由于碱基的错配和错误引发，这些短的发，这些短的DNADNA片段会含有少量的点突变。进一步片段会含有少量的点突变。进一步PCR PCR 反应中，反应中，它们之间可以相互同源引导和重组。组装成完整的基因长度，再利它们之间可以相互同源引导和重组。组装成完整的基因长度，再利用末端序列为引物扩增得到全长基因。用末端序列为引物扩增得到全长基因。Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第二节第二节 酶分子的改造酶分子的改造4.4.交错延伸法交错延伸法是一种改进的或简化的是一种改进的或简化的DNADNA改组法，在改组法，在PCRPCR反应中，将含不同点突反应中，将含不同点突变

30、的模板混合，加入单引物，进行多轮变性、短暂的复性变的模板混合，加入单引物，进行多轮变性、短暂的复性/延伸，反延伸，反复重复直到形成全长基因片段复重复直到形成全长基因片段（二）（二）酶分子定向进化的应用酶分子定向进化的应用1.1.提高酶分子的催化活力提高酶分子的催化活力2.2.提高酶分子的稳定性提高酶分子的稳定性3.3.提高底物专一性提高底物专一性4.4.改善酶的其它性能改善酶的其它性能Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第三节第三节 融融 合合 酶酶融合酶融合酶:将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白，称为融合

31、酶白，称为融合酶一、融合酶简介一、融合酶简介生成融合酶的途径：生成融合酶的途径：非理性设计，先构建库，再从库中筛选所需的融合体非理性设计，先构建库，再从库中筛选所需的融合体 理性设计，在了解蛋白质的结构与功能的基础上，有针对性理性设计，在了解蛋白质的结构与功能的基础上，有针对性地实现几个蛋白质之间的交换和融合地实现几个蛋白质之间的交换和融合融合酶构建策略：二级结构融合、功能域融合、整个酶融合酶构建策略：二级结构融合、功能域融合、整个酶蛋白的融合蛋白的融合Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第三节第三节 融融 合合 酶酶二、融合酶的应用二、融合酶的应用（一）（

32、一）理论研究方面理论研究方面 1.1.确定蛋白质结构与功能的对应关系确定蛋白质结构与功能的对应关系2.2.确定蛋白质之间的相互作用确定蛋白质之间的相互作用（二）（二）实际应用方面实际应用方面1.1.非催化特性的优化非催化特性的优化2.2.创造新催化活性酶创造新催化活性酶3.3.研究酶及其它蛋白质的定位及移动研究酶及其它蛋白质的定位及移动4.4.在酶内部创建别构作用在酶内部创建别构作用5.5.构建具有双催化活性的功能酶构建具有双催化活性的功能酶Enzyme EngineeringEnzyme Engineering1、什么是酶基因的克隆，其基本步骤有哪些？2、酶基因克隆有哪些常用的方法？3、原核生物基因表达系统有什么特点？4、真核生物基因表达系统有什么特点？5、举例说明酶异源表达的应用6、酶定点突变商业化试剂盒基本原理？7、酶定点突变常见有哪些方法？8、酶定点突变的概念、特点？9、酶分子定向进化的主要方法有哪些？Enzyme EngineeringEnzyme Engineering10、酶分子的定向进化有哪些方面的应用？11、试述DNA改组与交错延伸PCR的区别？12、什么是融合酶？13、融合酶的构建有哪些策略？14、融合酶有哪些方面的应用？