如何做好核酸检测.pdf

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1、如何做好核酸检测 及质控、防护工作 大同市医学检验质控部主任 - -王跃平新型冠状病毒感染的肺炎患者，随着疫情的蔓延，目前资 料表明，经呼吸道飞沫传播是经呼吸道飞沫和接触传播是 主要的传播途径。该病作为急性呼吸道传染病已纳入中 华人民共和国传染病防治法规定的乙类传染病，按甲类 传染病管理。我们医学检验实验室等人员主要接触患者的 血液、尿液、粪便等样本，这些均可产生气溶胶。本文撰 写如何做好核酸检测及质控、防护工作，首先要从检验前 （样本采集、运输等）、检验中（样本前处理、检测等）、 检验后（废弃样本处理等）三个方面，浅谈实验室/检验科 人员怎样做好防护，供大家参考。现在核酸检测遇到最大 的问题

2、就是标本采集，新冠诊断有其特殊性，主要是早期 无症状或轻症时，来自上呼吸道采样的咽拭子容易漏检， 下呼吸道样本取样又不方便，导致近期频频出现连续几次 才检出阳性的情况。所以规范样本采集、提高试剂检测灵 敏度，都是需要我们临床完善，毕竟核酸检测依然是金标 准。核酸检测同时应该尽快开展血清学检测!对隐匿和轻症 以及预后判断非常有必要! PCR实验室管理导语病原学特点及概论 新型冠状病毒属于属的新型冠状病毒，有包膜， 颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。 其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。 目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL- CoVZC

3、45）同源性达85%以上。体外分离培养时， 2019-nCoV 96个小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内 发现，而在Vero E6和Huh-7细胞系中分离培养需约6 天。临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现，少数 患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状。 新型冠状病毒病原学特点及概论新型冠状病毒DNA、RNA稳定性异同 新型冠状病毒属于属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，常为多形性， 直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。研究显示与蝙蝠 SARS样冠状病毒（BatSLCoVZC45）同源性达85%以上。目前已经获得该病毒的全 基因组序列、电镜照

4、片，体外分离培养已经成功。实验室检查： 结合上述流行病学史和临床表现综合 分析，我们实验室在发病早期外周血白细 胞总数正常或减低，淋巴细胞计数减少， 部分患者可出现肝酶、乳酸脱氢酶 （LDH）、肌酶和肌红蛋白增高；部分危 重者可见肌钙蛋白增高。多数患者C反应 蛋白（CRP）和血沉升高，降钙素原正常。 严重者D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进 行性减少。 在鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、 血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病 毒核酸。在此，我们重点谈谈如何做好核 酸检测及质量控制和防护工作。每个病例必须采集急性期呼吸道标本和急性期血液标本；重症病例优先采集下呼吸 道标本（如支气管或肺泡灌洗液等），

5、可根据临床表现与采样时间间隔进行采集。 下呼吸道标本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、 肺组织活检标本。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是 下呼吸道标本）。 血清标本：尽量采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早 （最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第34周采集。 采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用真空采血管。血清标本主要 用于抗体的测定，从血清抗体水平对病例的感染状况进行确认。血 清标本不进行核酸检测。粪便标本：出现腹泻症状的患者需采集便 标本。 检测标本采集种类 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽吸物。方法二 方法一 方法四 方

6、法三 将1根聚丙烯纤维头的塑料杆 拭子轻轻插入咽扁桃体及咽 后壁或鼻道内鼻腭处，停留 片刻后缓慢转动退出。将拭 子头浸入含3ml 病毒保存液 （也可使用等渗盐溶液、组 织培养液或磷酸盐缓冲液） 的管中，尾部弃去，旋紧管 盖。 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物： 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管 抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管， 接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的 粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导 尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。 支气管、肺泡灌洗液： 血液、粪便标本： 建议使用含有EDTA抗凝剂的真 空采血管采集血液标本5ml， 室温静

7、置30min，1500- 2000rpm离心10min。如患者发 病早期出现腹泻症状，则留取 粪便标本35ml。 冠状病毒标本采集方法 咽拭子、鼻拭子： 局部麻醉后将纤维支气管将收集器头部 从鼻孔或气管插口处插入气管注入5ml 生理盐水，接通负压，旋转收集器头部 并缓慢退出。收集抽取的粘液检验。样 本 的 采 集 样 本 的 运 送 样 本 的 接 收 与 保 存 检测样本的采集、运送和保存 采集运送：由经过生物安全培训的专人运送至 实验室，运送人员应佩戴帽子、一次性外科口 罩、手套、隔离衣，转运期间保持转运箱平稳， 避免剧烈震荡、颠簸。9 运输条件 离心 采集标本 标本采集运送 PCR实验室

8、 标本采集、运送、存储和检测暂按二类高致病性病原微生物管理，按照病原微生物实验室生物安全管理 条例及可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部令第45号）及在 生物安全柜内打开，取出标本，详细核对标本信息，做好交接登记。 标本采集、运送、存储和检测按二类高致病性病原微生物管理核酸的分子诊断检测技术发展概况同时具备以下三个条件：三级甲等 医院；根据病原微生物实验室生 物安全管理条例(国务院第4 2 4号令)， 具备在设区的市级人民政府卫生健 康主管部门备案的生物安全二级及 以上实验室；根据医疗机构临床 基因扩增检验实验室管理办法(卫 办医政发 2 0 1 0 1 9 4号

9、)，具备经过省 级卫生健康行政部门审核备案的临 床基因扩增检验实验室。 实验室资质：新型冠状病毒核酸PCR实验室等级必须为二级以上BSL PCR实验室核酸检测流程标本的离心在通风橱内进行，开盖、 取样、核酸提取等操作均在生物安 全柜内进行。 按试剂盒说明书编写试剂准备、核 酸提取、扩增检测、结果分析及报 告等的标准操作程序，并严格遵照 执行。参与检测提取的内参添加于 实验的全过程，设置阳性质控、阴 性质控. 检测流程:病 毒 颗 粒 DNA RNA FQ-PCR RT-FQ PCR 荧光信号检测 核酸提取 荧光PCR检测系统 加 样 新型冠状病毒核酸荧光定量PCR-荧光探针法检测操作步骤新型冠

10、状病毒核酸检测（PCR-荧光探针法）结果 原理：所谓的PCR-荧光探针法就是 通过对 PCR 扩 增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从 而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧 光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质，随 着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧 光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收 集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光 强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光 扩增曲线图 。 优点： 1、特异性好、引物、探针双重保证特异性， 方法学假阳性很少，使用荧光探针技术的PCR检测， 几乎没有方法学的假阳性。直接揭示病原体的存 在 2、扩增检测

11、同时进行，速度快，且不对扩增产物 进行处理，不易污染 3、PCR-荧光探针法检测灵敏度高，理论上扩增体 系中单拷贝的模板也能被检测出。 新型冠状病毒核酸典型荧光定量阳性PCR结果 新型冠状病毒核酸典型荧光定量阴性PCR结果PCR质量控制及结果报告 实验试剂、设备：使用到的核酸提取试剂、 荧光PCR检测试剂、全自动核酸提取仪、 一体化检测系统、荧光定量PCR仪均需取 得医疗器械注册证。 标本类型：检测的标本 类型需符合试剂说明书 中的标本要求。 质量控制：建议每批检测设立一个弱阳性质 控、三个阴性质控，三个阴性质控随机放在 临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，三 个阴性质控全部测定为阴性，视为在

12、控。反 之，则为失控，不可发出报告，应分析原因， 必要时重新检测样本。 结果报告：检验结果严格按照试剂说明书要求判读。 同一份标本中新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、N)特 异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现 单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新 检测。阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，包 括：样本质量差，如样本采集的过早或过晚；样本 保存、运输和处理不正确；技术本身存在的原因， 如病毒变异、PCR抑制等。PCR实验室工作人员防护标准 1、从事新型冠状病毒标本检测的技术人员应经过生物安全培训和具备相应的实验技能，并 采用生物安全三级实验室级别的个人防护。 2、三级生

13、物安全防护内容：医用防护口罩或N95口罩、双层乳胶手套、面屏、护目镜、工 作服外防护服、双层医用防护帽，加手卫生。必要时双层口罩（外医用防护口罩，内 N95）。个体防护 P C R实验室人员进出 进入 退出 公共 清洁区 更衣室 缓冲间 污染区 污染区 缓冲间 更衣室 公共 清洁区 淋浴间 PCR实验室工作人员防护标准1.个人防护应采用生物安全三级实验室防护级别 2.制订针对不同情况相应的消毒措施并实施。 3.定期监控各种消毒用品的有效性。 4.相关人员掌握消毒办法与消毒用品的使用。 5.保留各种消毒记录，记录完整。 PCR实验室制定各种消毒措施请所用门把手、电话等公共设施每 天使用1000m

14、g/L有效氯的消毒液消 毒3次（有个案报道，门把手2019- nCoV核酸检测呈阳性）。 五、所用门把手、电话 请 六、标本的容 器 1.每天试验前后使用1000mg/L有效氯的消毒 液进行桌面、台面及地面消毒2次。 2。每天试验前后用75%酒精对生物安全柜进 行擦拭消毒。 三、物表消毒 实验室配备充足的空气消毒机或紫外 线灯，每天试验前后常规消毒（空气 消毒机1h/次，紫外线灯30-60min/ 次）。 。 二、空气消毒 对新型冠状病毒对紫外线和热敏感， 56 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消 毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效 灭活病毒。 （一、抵抗力 实验室环境消毒 四、医疗废物

15、 医疗废物运送结束后，用 1000mg/L的含氯消毒液对运 送工具进行清洁和消毒。 转运及存放标本的容器使用前后用 1000mg/L的含氯消毒液进行擦拭消 毒。PCR实验室标本及消耗器材（携带传染病毒）等医疗废物管理 样本实验登记 具有专业技术能力 经过生物安全培训 实验使用完标本、消耗器材按标 本检测消毒后产生的废液，用含 5500mg/L的有效氯消毒液彻底灭 活后，倒入医院污水处理通道。 销毁记录 工作人员： 按照PCR实验室防护流程、进行个人防护配置，传播性病原体（如新型冠状 病毒）的操作应在BSL-2上进行，通过严格遵守预先制定的标准操作程序和管理 规范等综合措施，确保操作生物危险因子

16、的工作人员不受实验对象的伤害，确 保PCR实验室周围环境不受其污染。 所有医疗废物必须 经压力蒸汽灭菌处 理后方可离开实验 室，登记内容包括 医疗废物的来源、 种类、重量或者数 量、交接时间，最 终去向以及经办人 签名。辐射危险 生物安全柜：紫外灭菌后一定要 关闭紫外灯，并且打开鼓风 辐射危险 琼脂糖凝胶回收时一定要加放 紫外挡板或者佩戴防护镜。 离心机 u在装载离心管后应正确平衡 u离心管应始终牢固盖紧 u放置好离心管后盖上盖子才可开始离心 u离心机放置高度应使实验人员能看到离心机内部 u危险性病原微生物，必须使用可封口的离心桶 常用仪器使用的注意事项PCR实验室新型冠状病毒核酸风险评估报告

17、 风险评估作用 一、为PCR实验人员在实验活动中如何控制风险提供科 学依据和指导 二、识别风险大小和风险种类，为实验人员选择实验设 施条件、个人防护水平提供依据 三、为实验室生物安全管理提供依据，指导开展PCR 实 验人员管理、培训和操作的规范 事先评估，结合实际，全面评估，科学评估PCR实验室风险评估报告 风险评估的 主要内容： 1.病原微生物的风险评估 2.实验硬件设施的风险评估 3.检测设备的风险评估 4.实验人员的风险评估 5.实验方法的风险评估 7.危险材料的风险评估 8.实验器材的风险评估PCR实验室运行管理 按要素进行规范 按照程序文件进行管理 按照作业指导书规范操作 要求体系持

18、续有效运行 要求定期评审、不断改进、螺旋式上升 发现的符合新型冠状病毒感染的肺炎确诊病例流程：即可报当地卫计委，须将原始标本或 PCR扩增产物送省疾控中心或国家卫生健康委指定的第三方检测机构复核确认后，由省卫生健 康委疫情应对处置领导小组下设的诊断组根据病例临床表现、流行病学史和实验室检测结果等 进行评估确认。 常导致新型冠状病毒肺炎。手是最主要的传播媒介，其次为飞沫传 播。病毒经鼻、口、眼进入体内，主要在鼻咽腔中复制。由于新型冠状 病毒型特别多和存在抗原漂移现象 ，新型冠状病毒的免疫非常短暂， 再感染极为常见。通过飞沫或人与人接触传播 ，上述总结的新型冠状 病毒核酸检测的临床特点 ，也为各临

19、床科室医生在面临呼吸道可疑病 毒感染的患者提供了重要诊断参考价值 。因此如发现疑似病例或确诊 病例，建议采取严格的呼吸道疾病隔离措施。 由于采集和检测新型冠状病毒患者标本具有很强的传染危险， 实验操作的生物安全防护、严格规范的操作流程和防止实验室感 染显得尤为重要，另外实验室检测，必须有质量控制及安全防护措 施，并与其他实验室结果进行比较。 对PCR实验室诊断方法的结 果判断有如下建议：核酸检测阳性结果必须按照一个严格的程序进 行确认，尤其在低感染流行区，因为其阳性预示值较低，新型冠状 病毒核酸检测阴性的检测结果并不意味着没有感染,相信在国家的 积极支持与协调下,新型冠状病毒的特异性实验室检测标准化将进 一步发展。建议提高检测质量，集中的区域要考虑标本运送时间。 小 结PPT 模 板 下 载 ： 行 业PPT 模 板 ： 节 日PPT 模 板 ： PPT 素 材 下 载 ： PPT 背 景 图 片 ： PPT 图 表 下 载 ： 优 秀PPT 下 载 ： PPT 教 程 ： Word 教 程 ： Excel 教 程 ： 资 料 下 载 ： PPT 课 件 下 载 ： 范 文 下 载 ： 试 卷 下 载 ： 教 案 下 载 ： PPT 论 坛 ： 感谢聆听 批评指导 山 西 省 大 同 市 医 学 检 验 质 控 部 主 任 王 跃 平