大分子药物的免疫原性评价.pdf

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1、免疫分析实践领域独立评论员 章登吉 药物的免疫 原 性 评 价 什么类型的药物需要进行免疫原性评价 药物研发的哪些阶段需进行免疫原性评价？ 滴度实验要不要做？ 中和抗体何时开始做？ 细胞因子风暴的发生是否需要从T 细胞角度考虑？ 分析方法中耐药性要多高才算满足要求？ 标准阳性抗体如何制备如何制备、选择？ 临床前阶段为什么要做免疫原性评价？其意义 临床前免疫原性结果如何解读？ 对于统计学做法如何理解？ 长期稳定性要不要做？ 现行指导原则的缺憾在哪里？国内指导原则何时出来？生 物类似药可能要单独制定 免疫原性评价实践中的热点问题 基于风险的原则 （Risk-based ） 具体问题具体对待 （Ca

2、se by Case) 多层次递进式进行 （Multi-Tiered Testing Approach ） 免疫原性评价关键词 免疫原性相关基础理论与临床前安全评价 何为抗原，何为免疫原性（广义） 抗原（antigen）：指在机体中引起特异性免疫应答 反应的物质。 免疫原性（immunogenicity）：被注射入动物或人体内 后，使其产生循环抗体或改变免疫 细胞 的反应 性 免疫反应性 (immunorectivity) 指抗原分子能与相应免 疫应答的产物 ( 抗体或致敏淋巴细胞 ) ，在体内或体外 发生特异性结合的性能。 全抗原（complete antigen）：既有免疫原性又有 免疫反

3、应性 半抗原（hapten）：只能与特异抗体作用，但不引 起机体免疫应答的分子 药物安评中所指的免疫原性（狭义） Immunogenicity refers to the immune response of the host against the Therapeutic Protein The immunogenic response generally includes both cellular (T cell) and humoral (antibody) arms of the immune response, however we usually measure antibodi

4、es. Antibodies directed against TP (anti-drug antibodies, ADA) may consist of IgM, IgG, IgE, and/or IgA isotypes. -interactions between antigen presenting cells, T- helper cells, B-cells, and their associated cytokines 哪些药物需进行免疫原性评价？ Therapeutic proteins (Biologics/Biotherapeutics) are 40 aa polypep

5、tides whose active components are derived from a biological source by being produced in microorganisms and cells (humans and animals) using biotechnology -Not chemically synthesized -E.g. Hormones, cytokines, enzymes, antibodies, fusion proteins 40 aa polypeptides and chemically synthesized polypept

6、ides need not to be evaluate immunogenicity? ( 答案: ) 简单，如小于40aa 的 Exendin也被测出有ADA。 免疫原性产生原因？ 治疗性蛋白与内源性蛋白序列差异 结构改变 聚合 氧化 脱酰胺、降解 构象变化 药物储存条件 生产/纯化工艺 处方组分 给药途径、剂量与频次 患者的免疫状态 遗传背景 ADA检测的重要性 快速地清除，影响药代或药效学谱线,缩短或延长半衰期 ，改变生物分布 中和药物，损失药效 产生免疫效应，如过敏反应，超敏反应，血清病，免疫复 合物沉积 中和人体内源性的蛋白，导致缺陷综合征，甚至带来致命 危害 动物模型中的状态 需

7、要应 用于药 理毒理 数据的 解释 生物治疗药物是药物开发 阶段中 安全与 疗效评 价的需 要，也 是申报 提 交的关键要素 什么阶段需要做免疫原性评价？ 开发 临床前 临床 I 期 临床 II 期 临床 III 期 上市后观 察 免 疫 原 性 非临床试 验中 应关注免 疫原 性对生物 制品 药效学和 安全 性评价的 影响 。 治疗用生物制品非临床 安全性 技术审 评一般 原则 在临床前要对免疫原性做足够的评估，临床1期、2期要有基本 qualified的方法 进行评估，临床3期要有充分完整的验证的方法进行评价。 免 疫 原 性 什么阶段需要做免疫原性评价上，中美在要求上有差异，但国外药企往

8、 往自行做得很全面，从自觉性角度上还是建议国内把临床前免疫原性评 价以法规形式作要求。 临床前免疫原性评价的意义 动物模型的免疫原性不能直接外推至人 动物的免疫原性评价数据有助于对非临床毒理学和药理学 数据进行解释 动物模型的免疫原性可以揭示在临床试验中可检测到的潜 在的抗药抗体相关的毒性 可揭示生物类似药和参照药的差异 免疫原性分析方法的验证对于临床研究是需要的 免疫原性在临床前研究阶段的影响 一、对PK、TK的影响 ADA产生改变PK、TK profile 与药物活性位点或非活性位点结合 对于治疗性抗体药物可能会加速药物清除，减少药物暴露 量 对于蛋白和肽类药物可能会降低药物清除，增加药物

9、暴露 量 实践中干扰PK，TK中药物的检测 影响游离药物的检出 剂量关系曲线关系不好，难以判断蓄积和清除情况 对于ADA出现情况，数据解读时 需要根 据实际 情 况进行处理 免疫原性在临床前研究阶段的影响 二、对临床前药效的影响 中和抗体产生对临床前药效产生影响 与药物活性位点结合或改变药物活性位点结合，阻碍药物 功能结构域发挥治疗作用 免疫原性在临床前研究阶段的影响 三、对临床前安全性的影响 对药物暴露量的影响 ADA影响毒理学试验的毒代动力学检测 通过影响PK行为影响暴露量 对药理作用影响在安全评价中的可能关注： 毒理学伴随药效指标进行性测定 靶点相关的毒性检测 药物为内源性物质或作用于内

10、源性物质 -如促红细胞生成素（EPO）产生的抗体可攻击自身内 源性EPO，造成红 细胞再 生障碍 贫血 症 -其它内源性对应物存在的药物，如干扰素 ，IL-2 ，GM-CSF，促血小板生成素等有报 道针 对内源性对应物的抗体 免疫原性在临床前研究阶段的影响 三、对临床前安全性的影响 过敏反应 诱导产生IgM或IgG，特别是有时也诱发IgE，导致速发型 超敏反应 非特异性作用 注射反应 细胞因子释放 局部过敏反应 其它 免疫复合物沉积，影响肾脏；免疫复合物活化补体或效应 免疫细胞导致其它的免疫反应 临床前免疫原性评价结果解读 基本原则 不能直接外推，不能完全反应临床的免疫原性 结合PK、TK数据

11、分析动物暴露情况 结合动物毒性反应，综合考虑种属差异，评价临床前毒性 风险 基于风险评估的原则评判免疫原性，为临床免疫原性评价 和风险评估提供参考 很多拟用于人的生物制品对动物有免 疫原性 ，因此 该类产 品进行 长期毒 性试验 时,给药 期间应检测抗体以帮助解释试验结果 。应明 确抗体 反应特 点，如 滴度、 出现抗 体的动 物数、中和或非中和抗体等，并将抗 体的出 现与所 有药理 和/ 或毒理 的变化 综合考 虑。 尤其在解释数据时应考虑抗体形成对 药代动 力学/药效 参数、 影响范 围和/ 或不良 反应的 严重程度、补体活化或出现新毒性作 用等的 影响， 也应注 意评价 与免疫 复合物

12、形成和 沉积有关的病理变化。治疗用生物 制品非 临床安 全性技 术审评 一般原 则 临床前免疫原性评价考虑要点 基于作用机制与风险考虑原则 免疫原性产生高风险 考虑免疫毒性程度及范围 考虑PD指标及TK测定采样点及灵敏度 药理作用高风险 PD指标及时间点设置 靶向毒性相关指标设置 内源性靶点或内源性物质要密切关注药理相关作用 是否需要进行抗体分析或者说进一步的抗体分析： 滴度分析 中和抗体 抗体表征：如分型和抗体具体作用的结构域（如ADC、融 合蛋白） 临床前免疫原性评价考虑要点 采样时间点设置 基础值（给药前基础水平） 抗体产生时间（D10-D14，检测抗体的产生同时关注毒性 变化） 试验中

13、后期TK采血点附近（结合TK结果，评价药物暴露） 恢复期时间点设置（结合ADA评价消除情况） 临床前评价免疫原性采样点设置最好与PK、TK及相关PD指 标相一致 方法学考虑： 平台:普通ELISA、MSD，SPR，Gyros Assay format 层次：筛选、确证、滴度、中和抗体 其它 临床前免疫原性评价结果评价 评价原则 根据免疫原性抗体（如IgG）的产生和消除规律判断，不 依赖于单独某一个检测时间点结果 免疫原性评估结果需结合种属、暴露情况、药效学指标、 动物毒性表现等综合评价 充分考虑免疫原性可能导致的免疫毒性 根据具体药物，Case By Case 免疫原性评价PK/TK数据处理

14、方式： A：在计算平均值前剔除产生ADA个体的PK、TK数据 B:对影响PK行为的个体剔除数据 C:不管ADA产生，所以数据参与平均值计算 D:科学判断，Case By Case E：剔除和未剔除产生ADA的个体分别计算 临床前考虑动物数量少的情况下： 1 ）如果产生ADA动物个体数少剔除个体数据进行计 算 2 ）如果产生ADA动物个体数多可采用截断方式（剔 除样本 数据） PK/TK数据处理现状： 1)PKTK数据标准化非常困难 2 ）不同药物有不同生物学效应 3 ）不同的PK行为 4 ）不同实验设计和测定方法 ADA 分析方法的挑战与策略 免疫原性分析方法的挑战 一、多结构域药物： 多结构

15、域药物类型： Fc、HSA 融合蛋 白 PEG化药物 双特异性抗体 ADC药物 多结构域药物结构上的复杂性 使其免 疫原性 风险更 为复杂 ，分析 方法 建立更为复杂 注意点：通常需要在临床 试验中 区分与 药物结 合的表 位，根 据结合 功 能区来区分ADA 的风险 策略：基于风险、基于目 的、基 于数据 免疫原性分析方法的挑战 二、多聚体： 多聚体是天然结构或变性蛋白组 成的高 分子量 聚合体 生产各环节、产品运输、保存、 给药等 过程均 可能产 生 多聚体产生会增高产品免疫原性 风险， 并导致 严重的 副作用 免疫原性分析方法的挑战 三、游离药物干扰ADA检测： 游离药物与游离ADA结合

16、，影 响ADA检出 ，导致 假阴性 策略：采用酸化等方式破坏此干 扰 四、靶点干扰ADA检测： 来源于基质中双价或多价的游离 抗原（ 靶点） 导致假阳性 解决方式：预先用靶点特异性抗 原进行 封闭或 改变分 析的模 式 免疫原性分析方法的挑战 五、天然抗体的存在： 来源：机体因疾病因素或前期暴 露 结果：天然抗体存在使得筛选临 界值偏 高，假 阴性结 果偏多 策略：方法建立时空白基质中天 然抗体 采用统 计学方 法剔除 ；试 验前对天然抗体进行预筛 选，剔 除存在 天然抗 体的个 体，避 免其对 实 验结果总体评价的影响； 在样品 检测时 发现天 然抗体 存在解 读时需 通 过抗体滴度进行免疫

17、原性 的结果 解读。 六、中和抗体难点： 分析模式选择：基于药物 作用机 理；Cell-base 或LBA？ Cell Based assay更复杂 、变数 多、波 动大 阳性抗体: 须有中和活 性 真实样品的影响 七、统计方法的应用与理解 免疫原性研究策略 Non-clinic & Lower-risk Clinic or Higher-risk BP Refer: Inge Dreher, EBF, Barcelona, December 2009 Impact Assessment: PD/PK profile, Efficacy, Safety Titer 标准阳性抗体的选择 一、多抗

18、还是单抗？ 法规虽然说两者都可以，但建 议用多 抗，更 能反应 体内情 况，更 能 说明问题 用完整药物分子免疫产生 的抗体 还是仅 针对功 能区的 抗体？非针 对功能区的抗体不一定不 影响PK、TK 。 推荐早 期测总 抗体， 若果考 察 是否针对功能区域可以在 确证实 验时或 后期阶 段进一 步表征 时进行 ， 此时可以采用这样的抗体 帮助考 察。抗 体的使 用要基 于目的 。 二、抗体的种属来源 临床前：有人说用兔子， 但我强 调的应 该说是 可以用 兔子。 实验动 物 本来就是猴子，能得到猴 子的抗 体，还 用兔子 吗？ 临床阶段：猴子，当然也 可以由 病人血 清中得 到的抗 体。 观

19、点：种属虽没有具体要求，但 要尽量 倾向于 基于实 验目的 、实验 对 象、以及反应药物进入体 内的实 际情况 免疫原性方法学验证 筛选阈值 (SCP) 阴性空白个体：未给药个体、健康个 体 vs 目标疾病群体 个体数量：临床 50 ，临床前 15 ，至少3天3个不同批次，两个以上 的分析 人员 确认试验阈值 (CCP) 潜在阳性样品进行高浓度的药物处理(ADA) 潜在中和抗体阳性样品进行 1) 去除药物( 间接法) 或 2) 去除中和抗体( 直接 法) 处理 (NAb) 个体数量：临床 50， 15，建议筛选与确认同时进行 试验线性范围(钩状效应与灵敏度) 最低稀释倍数 vs 灵敏度 vs

20、方法阈值 灵敏度：临床：100 ng/mL， 临床前：250500 ng/mL； 系统适用性QC样品与精密度 阴性对照、低、中、高浓度阳性对照 （中浓 度不一 定要） 用于评价方法学表现的一致性 精密度： 批内精密度： 6 套系统适用性QC 样品/分 析批 批间精密度： 6 套系统适用性QC 样品/分 析批 x 6 分析批 免疫原性方法学验证 选择性与特异性 基质干扰：为给药个体、健康受试者/ 目标人群(最低10个): NC / LPC水平 药物干扰 （单抗药物：100 g/mL） 可溶性药物靶标物 RF 与其他Igs ：10-15 mg/mL 方法的耐药性： 耐药性与检测限、灵敏度息息相关

21、耐药性需要多大？ 方法学耐用性、耐受性 条件变化：关键试剂批号、孵育时间、温度、仪器、分析员、 MSD SA Plate、Read Buffer T 、Gyros Mixing CD 、 Biacore CM 5 芯片、再生次数 方法学转移：不同试验。 稳定性 基于样品采集、制备、运输、储存、分析等过程考虑 关键试剂的稳定性：质控样品、生物素/Sulfo-Tag 标记抗原 至少要做试验台稳定性，冻融稳定性 长期稳定性是否要考虑 稳定性数据的baseline建立、具体具体做法？争议点 免疫原性方法筛选阈值计算的统计分析 免疫原性方法筛选阈值计算的统计分析 方法确证阈值及QC范围的统计分析 生物类

22、似药免疫原性方法学注意点 采用与参照药一致的分析模式和分析 方法 注意交叉验证 保证足够的耐药性和灵敏度 一套方法和/或两套方法，两套 方法建 立的cutpoint 值的可 比性 一套方法 两套方法 通常以生物类似药建立方 法 分别以类似药和参照药建 立方法 以生物类似药和或参照药 制备阳 性抗体 以生物类似药制备阳性对 照抗体 同时对给予生物类似药和 给予参 照药的 样品 进 行 检 测 分别对给 予类似 药样品 和 给予参照 药样品 进行检 测 ， 并对阳性样品进行交叉检 测 以生物类似药和或参照药 对阳性 抗体抗 体进 行 交 叉 验 证 在临界值确定时应用相同 空白个 体群， 并用统 计的 方式确定两套方法确定的 临界值 无显著 差异 建议Cross-Check Samples用于两个药间的比较为佳 中和抗体分析 目标 建立药物可能被中和而导致的临床观测指 标改变 与 中和抗 体测定结 果 之间的相关性 中和抗体： 中和抗体是结合抗体的子集 中和抗体影响药物和靶点相互作 用 中和活性源于抗药抗体与药物结 合的表 位同药 物的活性 位点相 关，或 引起药物构象变化而影响药效的 发挥 方法验证内容与ADA检测基本相 同