蛋白表达步骤

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1、1培养基的配制原理步骤LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌, 其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛 选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源 于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。LB培养基的配制：成分胰蛋白胨(trypto ne)10g酵母提取物(yeast extract)5g 氯化钠(NaCI)10g固体培养基另加 琼脂粉 15-20g 加双蒸水至1000mL,用5moI/L N

2、aOH (约)调pH至，121C灭菌30min配制方法(1) 称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCI，置于烧杯 中。(2) 溶化 加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全 部溶化。(3) 调pH用1moI/L NaOH溶液调pH至。(4) 定容 将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。(5) 加琼脂 加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。(6) 分装、加塞、包扎。(7) 高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。2、大肠杆菌菌种活化原理菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级 增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接 种

3、数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因 为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养 环境中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解 菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、 液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80C冰箱冻结法、液氮超低温冻结 法。对于不同的保存方式活化的方式也不同：1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基 上，生长繁殖后，再重新转接一次；3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管

4、，取部分沙土粒 于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养 基中，增殖培养后再转接斜面；4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用 70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将 安瓿管顶部烧热， 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀 或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块， 使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；5 -80C冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管, 应立即放置38C-40C水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解 为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养

5、 基上进行培养6液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80C冰箱冻结法保存菌种复苏相 似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38C-40C水浴中快速 复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安 瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。步骤总结一下菌种活化需要以下几个步骤：第一配置菌种适宜生长的培养基第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培 养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落经过这四个步骤就

6、到达将菌种 从保藏状态活化的最终目的.举例大肠杆菌菌种活化方法：配活化培养基（LB）：活化大肠杆菌配方：酵母粉，1g蛋白胨，1g氯化钠，稀释到100ml复苏细胞（去掉DMSO及冷冻过程 中产生的有毒物质）材料：液氮中的细胞共1毫升：含20%血清（FBS）, 10%DMSO （防止细胞内 产生冰晶），培养基步骤：一、从液氮（约T90度）中取出细胞（管中有1ml细胞）（稍微抖掉 液体）二、快速放入37度水浴1分钟。三、加入1ml DMEM培养基融化冰晶。 四、全部移入离心管中，管口封口膜封口；五、离心：1200r/mi n, 5m in。六、 去上清（用大枪（1-5ml） 次吸出，吸时沉淀朝上）；

7、G2细胞沉淀较明显七、先（用1ml小枪）加到离心管中1 ml培养基并吹打吸出到培养瓶中， 再加1 ml培养基润洗离心管吸出到培养瓶中，然后用大枪加3ml培养基到培养 瓶中（补足5毫升）；八、培养瓶放入37度温箱。3、质粒的提取一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA,这些方法都含有以下3个步骤: 细菌培养物的生长。细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化。（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落,接种到培养物中（有含有行当抗生素的液体 培养基中生长）,然后从中纯化质粒,质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许 多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准

8、LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增 质粒DNA。然而，较长一代的载体（如PBR322）由于不能如此自由地复制，所以需 要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进 行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然 而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像 PBR322-类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然 不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素Ug/ml） 已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象 到的

9、工作任务。（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意 一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加 热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素:质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解 后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的 裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1）大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细 菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外 膜，再加入SDS 类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减

10、小了从具有正压 的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2）加200 u l新配制的溶液II。 溶液IIL NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均 与溶液II接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。3）加150U l用冰预冷的溶液III 溶液III5mol/L 乙酸钾 60ml冰乙酸水所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。4）用微量离心机于4C12 000g离心5分种，将上清转移到另一

11、离心管中。5）可做可不做:加等量酚:氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 C以12000g离心 2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提， 然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。7）用微量离心机于4C以12 000g离心5分钟。8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于 管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连， 并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续 用吸头通过抽真空除去附

12、于管壁的液滴。9）用1ml70%乙醇于4C洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空 气中使核酸沉淀干燥10分钟。i此法制备的高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一般约为:每毫升原细菌培 养物 3-5 |i goii. 如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1J DNA溶液加到另一含8 n l 水的微量离心管内，加1 l 10X限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温 育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20C。iii. 此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：3.煮沸裂解1）将细菌沉淀，所得重悬于350 lSTET中。STETL NaCL10mmol/L1mmol

13、/L EDTA5% Triton X-1002）加25 |d l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，用10mmol/L配制，振荡3秒钟以 混匀之。如果溶淮中pH低于，溶菌酶就不能有效发挥作用。3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。4）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。6）在上清中加入40 |d l 5mol/L乙酸钠和420 |d l异丙醇，振荡混匀，于室温放置 5分钟。7）用微量离心机于4C以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于 管壁的液滴除尽。除去上清的

14、简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连， 轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉 淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。9）加1ml 70%乙醇，于4C以12 000g离心2分钟。2）可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让 细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故 可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不 能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全 天然的超螺旋分子。3）一些大肠杆菌菌株（如 HB101 的一些变种衍生株）用去

15、污剂或加热裂解时可释 放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时 它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、 模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的 活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮 沸法。4）当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制备质粒 时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育（如 用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤（用酚:氯仿进 行抽提）可以避免此问题。5）目前这一代质粒的

16、拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就 可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是 要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂 解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现 象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大 量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。（三）质粒DNA的纯化常使用的所有纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭合环状这样两 个性质。例如，用氯化铯4臭化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决 于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所

17、不同。溴化乙锭通过嵌入奋 不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有 所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为 增加，从而阻止了臭化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合 更多的染料，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个臭化乙锭分子）。由于染 料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中 的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯-臭化乙锭梯度平衡离心已成为制备大 量质粒DNA的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。 其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离

18、质粒DNA和宿 主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。二、质粒DNA的小量制备细菌的收获和裂解收获碱裂解法煮沸裂解质粒DNA小量制备的问题与对策质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解1. 收获1）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中， 然后接入一单菌落，于30C剧烈振摇下培养过夜。2）将培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4C以12000g离心30秒，将剩 余的培养物贮存于4C。3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的 吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液

19、面。当液体从管中吸出时，尽 可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。2. 碱裂解法I）将细菌沉淀，所得重悬于1001用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L10mmol/LEDTA溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在101bf/in2X 104Pa）高压下蒸气灭菌15 分钟，贮存于4C。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的 管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上 清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有 乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，

20、管内无可见的液体（2-5）分 钟。II）用50丨含无DNA酶的胰RNA酶（20 ng/ml）的TE溶解核酸稍加振荡，贮存于 -20C。注:当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其 DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+ 存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤9）之间增加 一步，即用酚:氯仿进行抽提，可以避免这一问题。（二）质粒DNA小量制备的问题与对策裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题:1）有些工作者

21、首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割， 这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多 数情况下，用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依 然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。2）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定 是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。三、质粒DNA的大量制备在丰富培养基中扩增质粒 细菌的收获和裂解 收获 碱裂解法（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有 效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌

22、菌株中，采用 以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA，而且重复性也很好。1）将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600约。培养基中应 含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。2）将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基（预加温至37C）施放入 25ml对数晚期的培养物，于37C剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分）， 所得培养物的OD600值约为。3）可做可不做:加氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170|dg/ml。像 PBR322 一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要

23、通过扩增。这些 质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因 此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯 霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度， 极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加 入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。4）于37C剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。（二）细菌的收获和裂解1.收获1）用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置 离心管使上清全部流尽。2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。ST

24、EL NaCl10mmol/L1mmol/L EDTA2）按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。2，碱裂解法1）将冼过的 500ml 培养物的细菌沉淀物 来自收获细菌的步骤 3 重悬于10ml（18ml）溶液 I 中。溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L10mmol/L EDTA溶液I可成批配制，在10 lbf/i n2高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4C。2）加1ml（2ml）新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，溶于10mmol/L 。当溶液的pH 值低于时，溶菌酶不能有效工作。3）加20ml（40ml）新配制的溶液11。溶液IIL NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1

25、%SDS 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。4）加15n l（20ml）用冰预冷的溶液III。溶液III5mol/L 乙酸钾 60ml冰乙酸水所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置 冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0C放置后所形成的沉淀应包括染 体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。5）用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。 如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清 全部转到另

26、一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的 原因通常是由于溶液I与细菌裂解物混合不充分步骤4）。6）上清过滤至一 250ml离心瓶中，加体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10 分钟。7）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4C离心，盐也 会了生沉淀。8）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70%乙醇洗 涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴， 于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。9）用3ml TE溶解核酸沉淀。10）纯化。四、质粒DNA的纯化聚乙二醇沉淀法质粒DNA氯化铯-溴化乙锭梯度

27、平衡离心法纯化闭环DNA（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA1）将核酸溶液所得转入 15mlCorex 管中，再加 3ml 用冰预冷的 5mol/L LiCl 溶液，充分混匀，用合适转头于4C下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉 淀高分子RNA。2）将上清转移到另一 30mlCorex 管内，加等量的异丙醇，充分混 匀，用 SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏，回 收沉淀的核酸。3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70% 乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁 的所有液滴，

28、敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量 乙醇蒸发殆尽。4）用500 ,含无DNA酶的胰RNA酶（20 ig/ml ）的TE溶解沉淀，将溶液转到一 微量离心管中，于室温放置30分钟。5）加500 1丨含13%（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的LNaCI，充分混合，用微量离心 机于4C以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。6）吸出上清，用400 il TE溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。7）将水相转到另一微量离心管中，力加 100 11 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2 倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4C以12 000g离心5分

29、钟，以回 收沉淀的质粒DNA。8）吸去上清，加200 1 1处于4C以12 000g离心2分钟。9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500 1 1 TE溶解沉淀1:100稀释用TE后测量OD260,计算质粒DNA的浓 度（1OD260=50 1 g 质粒 DNA/ml），然后将 DNA 贮于-20C。IPTG诱导原理诱导蛋白表达的原理及方法步骤的乳糖操纵子（元）含Z、丫及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和 乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调节基因Io I 基因编码一种阻遏蛋白，后者与0序列结合，使操纵子（元）受阻遏而

30、处于关闭 状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位 点。由P序列、0序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的 编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时， lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与0序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳 糖存在时，lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中，真正的 诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b 半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。 后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与 0

31、 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂， 不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。材料1、诱导表达材料(1 ) LB (Luria一Bertani)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 适用范围：大肠杆菌(2 ) IPTG贮备液：2 g IPTG溶于10 mL蒸馏水中，0 22 m滤膜过滤除 菌，分装成1 mL /份，一20 C保存。(3 ) IX凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tri

32、s -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS (电泳级) 溴酚蓝10 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 )酶溶法(1) 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI(2) 50 mmol / L苯甲基磺酰氟(PMSF )。(3) 10 mg / mL 溶菌酶。(4) 脱氧胆酸。(5) 1 mg / mL DNase I。2 )超声破碎法(1 ) TE缓冲液。(2 ) 2XSDS -PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI (

33、 pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS 溴酚蓝20 甘油 实验方案 1、外源基因的诱导表达1) 用适当的限制性内切核酸酶消化载体 DNA 和目的基因；2) 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5a感受态细胞中；3）分别挑取单菌落接种于5mLLB （ gLT氨苄青霉素）中，37C培养过夜；4）以2 %体积比转接于2ml LB（ gLT氨苄青霉素）中，37C继续培养hr, 至细菌对数生长期，加L IPTG 2 |!丨诱导3-4 hr，同时设立不加IPTG诱导 作为对照；5）取上述菌液1 mL， 12000 rpm离心10min，收菌沉淀；6）重悬于冰的100

34、H l PBS中，加入PMSF至终浓度为10mmol/L。震荡器震 荡混匀，加入2X加样缓冲液，煮沸 10 min 变性，12,000 rpm 离心 10 min；7）分别取诱导前和诱导后的样品10 11l进行SDS-PAGE电泳分析。（PS：如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30 -32 C培养数小时， 使培养液的OD600达，迅速使温度升至42 C继续培养3-5h ；如果表达载 体的原核启动子为tac等，则37 C培养细菌数小时达到对数生 长期后加IPTG至终浓度为1 mmol / L,继续培养3 -5h）。2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1 ）细菌的裂解常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化 学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法、已在工业生产中得到应 用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的 实验步骤。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；BT,3 -葡聚糖酶；B-1,6 -葡聚糖酶； 蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵 母作用显着。主要步骤为：