细胞凋亡实验步骤及注意事项 细胞爬片制备详细过程 肿瘤细胞侵袭实验

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1、细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死 细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡 普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定 生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自 主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆 浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进 一步融合将细胞分成多个完整包裹的

2、凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消 化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引 起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为 180-200bp 或它的整倍数的 各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder （梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即 丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎 症反应，坏死过程中细胞核 DNA 虽也降解，但由于存在各种

3、长度不等的 DNA 片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋 亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏 感程度。三尖杉酯碱（HT ）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血 病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.025pg/ml范围内作用2小时， 即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1pg/ml HT在 体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide PI）对细胞

4、进行双重染色，可以 区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏 死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死 细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可 跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料 且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与 DNA 特异结合(主要结合于 A-T) 碱基区)，显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱(HT)，300|jg/ml, 100mmol/L Tris-H

5、Cl(pH7.5)，5mol/LEDTA 缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc (pH4.8 )；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1% 琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500pg/ml； Ho33342母液：2mmol/L。2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器(1ml， 100pl)0.5、 1.5ml 离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37C, 5%CO2 条件下培养。五、方法步骤1 、三尖杉酯碱诱发 HL-60 细胞凋亡(1

6、)实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记、，每瓶含约6ml 培养液，置 37C， 5%CO2 培养箱培养。(2 )实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，号瓶加入三尖杉酯碱200pl， 使终浓度为1pg/ml，号瓶中加入同等量PBS (pH7.4 )作对照。共同放入培 养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞(1) 染色:将瓶中的细胞摇匀取200pl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342 母液2l, PI 201，染色15分钟。(2) 滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后 的细胞悬液10pl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫

7、外激发光，高倍镜下 观察，区别三种细胞，并注意三者比例。注意 1. 诱导培养 HL-60 细胞时间要准确；事 2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。项 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。 凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细 其 胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己 他 结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和 细胞膜进一步

8、融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞 噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其 它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。 核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为 180-200bp 或它的整 倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电泳，可显示以 180-200bp 为 基数的 DNA ladder （梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早 期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物， 引起炎症反应，坏死过程

9、中细胞核 DNA 虽也降解，但由于存在各种长度不 等的 DNA 片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱 导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对 刺激的敏感程度。【爬片的准备】1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2. 应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于 6 孔板、12 孔 板或24 孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔 科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色 时再将之切开

10、，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。3. 将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗 20 遍， 再置于无水酒清中浸泡 6 小时，再用三蒸水冲洗 3 遍（个人认为主要目的是将酸 冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养 皿中烘干后进行高压消毒。4. 高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。5. 关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我 在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞 化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。【细胞爬片】1. 胰酶消化细

11、胞后计数重悬细胞于完全培养基中。2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基， 目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬 液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较 紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起， 用小镊子取出就可以了。如果要做诸如 24h，48h，72h 等这样时间点的实验的话， 将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火

12、焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继 续培养。细胞爬片的固定】 细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS 洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在 洗的过程中有可能会脱落。另外在保存细胞爬片的时候，我一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然 后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避 免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20C保存2-3个月的片子做 免疫组化是没有问题的。以下为常用的固定液1. 冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。将纯的丙酮预先放入冰箱-20C后便为冷丙酮（放心，丙酮在此

13、温度不会为固体 的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20C（丙酮有很强的挥 发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后， 室温吹干，然后放入-20C保存。2. 多聚甲醛（常用4%）：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分 化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20C保存3. 95乙醇，可用于免疫组化。 优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性 的作用轻，固定后可再溶

14、解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应 强度室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20C保存4. 甲醛（福尔马林）应用最广优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联 形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造 成假阴性的染色结果。肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay）肿瘤细胞侵袭实验（Tumour InvasionAssay ）可以：（1）研究各种细胞 因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药 研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。实验方法Mat

15、 rigel基质膜模型Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、 接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能 在 DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为 相似。滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过， 必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Mar trigel的滤膜， 这与体内情况较为相似。铺有Martrige的滤膜放在以Blind Well空或MICS腔上下室之间，铺有Martrige面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小 鼠 3T3 条件培养液或人睾

16、丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细 胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的 实验时间与Martrige的用量有关，选择25ugMartrigel铺膜，16小时后观察 方实验法 结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表 方原法理 面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜， PE 染色，在光镜下观察统计穿过Martrige的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析， 这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel 加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72 小

17、时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进 人下腔溶液中因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在 内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好 的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。在上述分析中，如果不在膜上铺Martrige而直接将8um孔径滤膜安放在 侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析 细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或 FN 或在滤膜下表面铺上 LN 或 FN ，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。实验Matrigel基质胶试剂、试剂盒DMEMIFNy结晶紫染料溶

18、液醋酸低血清 DMEM培养基 FBSDMEM培养基仪器、耗材24transwell（Cos te离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验 一、溶液配制步骤 1. DMEM(1) NEA 液 (1 pg/pl, 1 mg/ml )(2) 母液 0.1 ml (5 mg ) + ddH2O up to 5 ml；过滤消毒，-20C保存。2. NE-DMEM ( -6 M)NE-A 液(1 pg/pl， 1 mg/ml) 20.5 pl DMEM UP TO 100 ml 过滤消毒，4C保存3. NE+CGRP-DMEM (-6 M， 100 ng)(1) NE-A 液(1 pg/pl， 1 mg/ml

19、) 20.5 pl(2) CGRP - 储存液 50 pl(3) DMEM UP TO 100 ml(4) 过滤消毒，4C保存4. NE+IFN-DMEM ( -6 M， 50 ng)(1) NE-A 液(1 pg/pl， 1 mg/ml) 20.5 pl(2) IFN-丫 (25ng/pl) 25 pl(3) DMEM UP TO 100 ml(4) 过滤消毒，4C保存。5. 低血清 DMEM 培养基(上室)6. 20%FBS-DMEM 培养基(下室)7. Ma trige基质胶(1) 10 mg/ml, 5 ml,分装成 0.5 ml只 10 个 EP 管中。(2 )用时加入0.5 ml的

20、DMEM 。(3) Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。二 、 准备1. 溶胶，4C过夜。2. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试 验前-20C预冷。三、包被基底膜(冰上操作)1. 用无血清的冷细胞培养基DMEM 稀释Matrigel胶。2. 取100 ul稀释胶加到24-well transwe上室中。3. 37C孵育 transwell至少 4-5 h。四、水化基底膜1. 用无血清培养基轻洗凝胶 。五 、 准备细胞悬液和小室1. 消化法从细胞培养瓶中获取细胞。2. 用培养基洗3遍。3. 重悬细胞，5x105 cells/ml 1% FBS 。4

21、. 上室加200 ul细胞悬液。5. 下室中加入600 ul细胞培养基，含有5 ug/ml fibronectffe为黏连亚族。六 、 孵育37 C, 20 to 24 h。七 、 染色和计数1. 棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。2. 移去 transwell,s 倒置,风干。3. 24孔板中加入500 pl含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培 养基中, 37C 30min 后取出, PBS 清洗。4. 直径上取4个视野，照相，计数。5. 24孔板中加入500 pl 33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10 min， 充分溶解。取出小室， 24 孔板于酶标仪上 570nm 测 OD 值，间接反应细 胞数。展开1. 照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下 观察、照相。注意事项2使用Matrivgel前应从-20C转移至4C待其自然溶化（如过夜放置）， 避免反复冻融。3使用时需接触Matrivgel的试管、移液吸头等均应预冷于4C。4.使用Matrivgel时注意无菌操作。