组织培养实验一1

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1、实验一 植物组织培养实验的准备（一）、实验室的设计与布局1、目的要求通过认知实习，了解植物组织培养实验室的布局，掌握植物组织 培养的程序，同时熟悉组织培养中涉及的各种仪器设备和器皿用具。2、仪器与用具超净工作台、蒸馏水发生器或纯水发生器、高压灭菌器、普通冰 箱、微波炉、煤气灶或电炉、显微镜、万分之一（或千分之一）电子 天平、恒温箱、烘箱、各种培养器皿、分注器、各种实验器皿和各种 器械用具。3、方法步骤1结合所学理论知识，学习组织培养实验室守则及有关注意事项。2了解植物组织培养的具体流程。3了解组培实验室的构建情况，包括准备室、缓冲室、无菌操作 室（又称接种室）和培养室的设计要求。4了解仪器设备

2、的名称、用途及使用方法。5了解实验室中培养材料的一些常用参数，如培养间的温度、光 照时数、光照度等。4、作业 1植物组织培养实验室一般由几部分构成？各个部分的功能主要有 哪些？植物组织培养常用的设备有哪些？ 2每人设计一个植物组织培养实验室的组建方案。二）、培养器皿的洗涤1、目的要求了解各种洗涤液的特性，掌握酸液的配制方法和组织培养中常用 器皿的洗涤技术。2、基本原理由于组织培养过程中器皿的重复利用，特别是培养基中有机物质 及培养组织分泌物的附着，影响再次培养，导致实验结果发生误差， 甚至使培养组织受到毒害。同时，一些新制玻璃器皿，都部分的存在 碱性游离物，也影响到实验结果的准确性。因此，新的

3、或重新使用的 器皿都必须认真清洗，使其达到不留任何残留物的要求。因不同培养 器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗的方法也不同。3、试剂与主要用品（1）仪器用具 毛刷、塑料盆、天平、量筒、烧杯、洗耳球、洗 刷装置（全自动洗涤机）、高压灭菌器、耐酸手套、玻棒、需洗涤器 皿等。（2）试剂 肥皂粉、洗衣粉、去污粉、洗洁精、重铬酸钾、浓硫 酸、蒸馏水、纯乙醇或 95%的乙醇等。4、操作步骤（1）玻璃器皿的洗涤（酸洗）玻璃器皿的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。 浸泡 新的或用过的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，以软化 和溶解附着物。新购置的玻璃器皿含有游离碱，应先用自来水简单冲 洗，再用1%5%

4、的HCl浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附着有大量 有机物质及培养组织的分泌物，干涸后不易涮洗掉，故用后应立即浸 入清水中以备刷洗；被杂菌污染的培养瓶或培养皿等玻璃器皿，应先 高压灭菌20min,倒掉污染的培养基后，再浸入清水中浸泡以备刷洗。 刷洗 将浸泡后的玻璃器皿放入肥皂液或洗衣粉液中，用毛 刷反复刷洗，刷洗中要不留死角，并防止破坏玻璃表面的光洁度。将 刷洗过的玻璃器皿冲洗干净、晾干，准备浸酸。 浸酸 将上述玻璃器皿浸泡到重铬酸钾洗涤液（又称酸液） 中，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面残留的物质。根据洗涤液中 含硫酸的比例，将洗涤液分为强酸，次强酸和弱酸三种（表2-1）。 根据需要配制洗涤液，

5、洗涤液对玻璃无腐蚀作用，去污效果好，用其 洗是保证器皿洁净的关键一环。配制洗涤液时，操作者必须小心认真，戴耐酸手套和防护眼镜，并严格按下列方法进行。表1重铬酸钾洗涤液的配方成分强液中液弱液重铬酸钾（g）63120100H SO (ml)241000200100蒸馏水（ml）20020010001）按配方称量好重铬酸钾和蒸馏水，然后将重铬酸钾完全溶于蒸馏水中（可加热）。（2）按配方把工业用浓硫酸缓慢（以产热很少为宜）加入冷却的（1） 中，边加边搅拌。（3）自然冷却、备用。洗涤液为强氧化剂，去污力强，可以洗去玻 璃器皿或瓷质器皿上的有机物，切不可洗涤金属器皿。配制、盛装洗 涤液的容器应防酸、耐热、

6、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或 耐酸塑料制品。洗涤液在使用过程中和使用后都应保持密闭，防止氧 化变质。新配制的洗涤液呈棕红色，当使用时间过久，洗涤液的颜色 变暗、发绿或浑浊时，应弃去（深埋地下），重新配制新的洗涤液。一般来说，新的和用过的玻璃器皿都应浸酸，那些无法用毛刷刷 洗的用品（如吸管、滴管等）更要靠浸酸去除污物。浸酸时，器皿应 完全被洗涤液充满和覆盖。浸酸时间不少于6h, 般要过夜或更长 时间。将器皿放入洗涤液时，应小心操作，防止伤及皮肤、眼睛或衣 服。从洗涤液中取出器皿时,应沥干洗涤液,并将浸酸的器皿放入合 适的容器,如塑料盆中运输。 冲洗 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗,

7、浸酸后器 皿是否冲洗的干净,直接影响到组织培养的成败。冲洗可用洗涤装置, 也可手工操作。手工洗涤浸酸后的器皿时,每件器皿都至少要重复“注 满水一一倒空” 15次以上，最后用蒸馏水浸洗23次，晾干或烘干 后包装备用。载玻片与盖玻片的洗涤：先用流水冲洗，再将其浸入含有 1%2%盐酸的95%乙醇液中浸泡612h,流水冲洗后再浸入加了 12滴氨 水的80%的乙醇中1h,取出用绸布擦干，保存在载玻片盒或培养皿中 备用。2）橡胶制品的清洗新购置的橡胶制品（如胶管，胶塞，橡皮乳头等）的洗涤方法如 下：0.5mol/L 的 NaOH 煮沸 15min流水冲洗一0.5 mol/LHCl 煮沸 15min流水冲洗

8、一自来水煮沸2次一蒸馏水煮沸20min-50C 烘干备用。用过胶塞的洗涤方法基本同玻璃器皿，但胶塞洗刷的重点 部位是胶塞使用面，应逐个刷洗。（3）塑料制品的清洗塑料制品的特点是：质地软，易出现划痕；耐腐蚀能力强，但不 耐热。其清洗程序为：使用器皿后立即用流水冲洗一浸于自来水中 过夜一用纱布或棉签蘸50C洗涤液的刷洗一流水冲洗一晾干一 浸于洗涤液中15min流水冲洗1520遍一蒸馏水浸洗3次一晾 干备用。（4）大量培养瓶的清洗（碱洗） 在规模化的组织培养生产中，对大量的培养瓶用洗衣粉进行洗涤后，用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗 23 次即可，将瓶倒置晾干备 用。被杂菌污染的培养瓶等玻璃器皿，应先高压

9、灭菌20min,倒掉污 染的培养基后，再按照上述方法洗涤。5、作业1各种培养容器、器皿洗涤方法有何不同？ 2碱洗、酸洗的作用是什么？配制酸液时应该注意哪些事项？（三） 植物组织培养中常用设备和仪器的使用1、目的要求通过实训，掌握植物组织培养的主要设备和仪器的使用方法、操 作规程及保养方法等。2、仪器和设备电子分析天平、超净工作台、高压灭菌器、酸度计等。3、方法步骤（I）电子分析天平（感量00001g）以 FA/JA 型多功能电子天平为例说明电子天平的使用方法，这里 重点介绍几个常用功能键的操作方法。 天平的放置 天平应置于稳定的工作台上，避免震动、阳光照射 和气流干扰。 操作方法（1）天平调平

10、 在使用前观察水平仪，如水平仪水泡偏移，需调整 水平节脚，使水泡位于水平仪中心。（2）开机 接通电源。天平通电后就开始工作（显示器未工作）通常需预热（15min）以后，方可开启显示器进行操作使用。（3）开启显示器键（ON）只要轻按一下 ON 键，显示器全亮“8888888%”对显示器的功能进行检查，约2 秒后显示天平的型号，例 如：“-1004-”，然后是称量模式“O.OOOOg”。（4）清零、去皮键（TAR） 置称量容器或称量纸于秤盘上，显示出容器或称量纸的质量，然后轻按 TAR 键，显示消隐，随即显示“0.0000g”，容器或称量纸质量值已去除，即去皮重。（5）称量 用试剂勺轻轻将试剂置于

11、称量容器或称量纸中，称取所需要的量。试剂不可掉在容器或称量纸外。6）关闭显示移去称量容器或称量纸，轻按0FF键，显示器熄灭，清扫电子天平。若要较长时间不再使用天平，应从电源插座上拔 下插头。（II）梅特勒-托利多320pH计1设置校准点 要获得最精确的 pH 值，必须周期性的校准电极。320pH计允许选择一组（三种）校准缓冲液。校准时可采用所选之缓冲液组中的两种溶液。有三组缓冲液供选择：组 1 （b=l）： pH 4.00、7.00、10.00；组 2 （b=2）： pH 4.01、7.00、9.21；组 3 （b=3）： pH 4.01、6.86、9.18。按下列步骤选择校准缓冲液：按“ o

12、n/off ”关闭显示屏。按住“mode ”且再按“ on/off”。松开“mode ”显示屏显示b=1 （或选择 的缓冲液组）。按“cal”显示b=2,或b=3,按“read”在缓冲液组 显示时选择合适的组别。即使断电，320pH计也可保留此项设置，不 需要经常进行此项设置。2校准pH电极 如果使用ATC探测器（或含ATC的电极），缓冲液 温度会被测定并补偿。如果不使用ATC探测器，320pH计则认为温度 是 25C。第一点校准：选用与pH7接近的缓冲液校准第一点，将电极放入 第一个缓冲液并按“ cal”，320pH计在校准时自动确定终点(即显 示该缓冲液的pH值)，要人工定义终点，按“re

13、ad”，当到达终止 时指示器显示相应的缓冲液pH值。第二点校准：应使用与被测样品接近的缓冲液进行第二点校准操 作。因植物组织培养的培养基大多数pH范围为5.56.0,因此宜选 用4.00 (或4.01)的缓冲液。将电极放入第二种缓冲液，按“cal”， 并按第一点校准步骤操作。当显示静止时电极斜率值会简要显示。注意：校准pH电极的两种缓冲液pH应与设置的校准点缓冲液一 致。例如：设置校准点为组3 (b=3)，则校准pH电极第一点时缓冲 液应为pH6.86，第二点时缓冲液应为pH4.01。3. 测定pH值 要测定某一样品的pH,将电极放入样品中并按“read” 启动测定过程，小数点会闪动。显示屏同

14、时显示数字式及模拟式 pH 值。4. 注意事项(1) 在使用电极之前，将保湿帽从电极头处拧去，并将橡皮帽从填 液孔上移走。(2) 在将电极从一种溶液移入另一溶液之前，需要用蒸馏水或下一 个被测溶液清洗电极，用吸水纸将水吸干，切勿擦拭电极，否则会产 生极化和反应迟缓现象。(3) 小心使用电极，切勿将之用作搅拌器。在拿放电极时勿触碰电 极膜。电极膜的损伤会导致精度降低和反应迟缓现象。(4) 测定小体积样品时，请确保液体连接部能被浸没。(5) 使用结束时，电极需在填充液内保存，不能使其干燥！(Ill)立式压力蒸汽灭菌器1结构与特点 以上海医用核子仪器有限公司生产的 LS-B50L 型立 式圆形压力蒸

15、汽灭菌器为例说明其使用方法。灭菌器内装电加热器、 灭菌计时器、压力温度自动控制调节器、安全阀、放汽阀、压力温度 指示表以及灭菌结束报警器和自动切断加热电源等装置。2高压灭菌器操作程序 加水一放置需灭菌器物一密封一预置灭 菌温度一设置灭菌时间一加热(排放冷空气)一灭菌一结束。(1) 加水。打开灭菌器盖，取出灭菌桶，向灭菌容器内注入清洁软 化水，水位应浸没容器内水位标志。(2) 堆放。将被灭菌之物包扎好后，顺序放置在灭菌桶内的筛板上， 包与包之间必须留有适当的空隙。(3) 密封。灭菌桶放入主体后，将灭菌器盖盖好，按顺序将相对方 位的紧固螺栓予以均匀地旋紧，使盖与桶体密合，不宜旋得太紧，以 免损坏橡

16、胶密封垫圈。打开放汽阀，安全阀不可打开。(4) 预置灭菌温度。预置灭菌温度是通过压力温度控制器旋钮预置，温度预置范围109C126C。顺时针方向旋转钮，灭菌温度 预置值减小，反之，预置值增大。满刻度值为126C，可根据需要预 置灭菌温度(见图 3-1)。(5) 设置灭菌时间。按照不同的灭菌物品，将计时器旋钮按顺时针方向旋至所需的时间刻度上。培养基常用的灭菌时间为20min。图3-1灭菌器上的压力控制器、定时器、防汽阀(6) 加热一排冷空气。首先合上漏电过载保护器开关，将电源按至 “开”位置，电源指示灯亮，灭菌器进入等待状态，当预置灭菌温度，预置灭菌时间后，灭菌器自动进入加热程序。“加热”指示灯

17、亮，电 热管工作。开始加热时应将放汽阀扳手拨至放汽位置(见图3-1), 使灭菌器内冷空气排放，待有较急促的蒸汽喷出时，将扳手拨至关闭 位。此时压力表随着加热逐渐上升，指示出灭菌器内的压力。(7) 灭菌。当灭菌器内蒸汽压力、温度升至预置灭菌温度值时，加 热灯由“亮”变“熄灭”，同时计时指示灯“亮”，灭菌计时器自动 进入并自锁，开始计时。此时应微调压力一一温度控制器，使灭菌器 压力一一温度值达到预置值，确保灭菌效果。在预置灭菌时间内自动 进入恒温控制程序，电热管自动间歇工作。待灭菌时间到达设置时间 后，灭菌结束，蜂鸣器发出响声，自动切断加热控制电路。(8) 结束。将“电源”接至“关”位置。如消毒灭

18、菌物品为溶液和 培养基等，在灭菌结束后，切忌立即放汽，否则会由于压力突然降低 而剧烈沸腾，导致瓶子破裂溶液溢出。应让其自然冷却，容器内压力 因冷却而下降至接近“零”位时，再将放汽阀打开，方能打开灭菌器 盖取出灭菌桶。3注意事项（1）在灭菌器开始加热时，必须将“放汽阀”扳至放汽位置，使灭 菌器内的冷空气逸出，确保良好的灭菌效果。（2）不同类型的物品最好不要同时灭菌，以免顾此失彼，造成损失。 被灭菌物品的溶液，应灌注在耐高温的玻璃瓶内，切勿灌注太满。一 般灌至瓶容积的1/23/4即可，且勿用没有通孔的瓶塞（如橡胶塞 或软木塞等）。（3）压力温度控制器一旦调定预置值后，一般来说，可重复使用， 以后不

19、必再重新调定，但要经常观察比值有否变动。（4）过载漏电保护试验按钮具有用于检验该保护器是否能正常工作 的功能。此按钮平常不要经常使用，保护器开关也不能作为电源开关 使用，以免影响保护器精度。（5）其他厂家生产的高压灭菌器在使用方法上会有一些不同，使用 前必须认真阅读使用说明书，或向实验指导教师请教，且不可盲目操 作。（W）超净工作台 结构与特点 超净工作台是植物组织培养技术中常用的仪器，是 提供局部无菌工作环境的空气净化设备。工作台由机箱、高效过滤器、 可变风量送风机组、工作台面、操作板等几大部件组成。其工作原理 是将室内空气经预过滤器过滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空 气过滤器过滤后从出

20、风面吹出，形成洁净气流。洁净气流以均匀的断 面风速流经工作区，从而形成高洁净的工作环境。 使用操作（1）新安装的或长期未使用的工作台，使用前必须用超净真空吸尘 器或不产生纤维的物品认真进行清洁工作。长期不使用的工作台应拔 下电源插头。（2）使用前应提前 20min 同时开启紫外灯和风机组工作，工作 20min 后关闭紫外灯。要经常用75%乙醇将紫外灯表面和工作区的表面擦干 净，保证其灭菌效率。（3）工作台面上禁止存放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流 不受干扰。（4）禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免做明显扰动气 流的动作。（5）当需要调节风机风速时，用工作台操作面板上的轻触型开关进 行调节（按电压分为五档：140V, 150V, 160V, 180V, 220V）。风机 调节电压指示由红、绿双色光排显示。风速每递增一档，光排增加两 格红色替代原来的绿色；反之,风速每递减一档,光排增加两格绿色 替代原来的红色显示。（6）禁止在预过滤器进风口部位放置物品,以免挡住进风口造成进 风量减少,降低净化能力。5、作业1. 天平使用中应注意哪些事项？2pH 计使用中应注意哪些事项？3高压灭菌器使用中应注意哪些事项,如何确定冷空气已排出？ 4超净工作台使用中,应注意哪些事项？