丹参酮IIA在卟啉单胞菌属感染的载脂蛋白E敲除的小鼠中减弱动脉粥样硬化的形成

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1、丹参酮iia在卟啉单胞菌属感染的载脂蛋白e敲除的小鼠中减弱动脉粥样硬化的 形成丹参酮iia （ TSA ），种从丹参中分离的药物活性成分，由于它的抗炎，抗氧 化和抗脂肪形成的作用可能预防心血管疾病。卟啉单胞菌，一种主要的牙周病原 体，可能有助于动脉粥样硬化的进展。这里，我们研究研究TSA对于感染卟啉 单胞菌的ApoE-/-小鼠中动脉粥样硬化的作用。8周大的ApoE-/-小鼠被随机 分为（a）磷酸盐缓冲液（PBS）,（b ）卟啉单胞菌组和（c ）卟啉单胞菌+TSA （60mgkg-lday-l ）组。这些小鼠被注射（a ） PBS，或（b ）和（c ）卟啉单 胞菌每周3次，总共10次。 8周后，

2、在血清中动脉粥样硬化的风险因素，和在 心脏动脉和肝脏组织中对所有小鼠用油红0动脉粥样硬化细胞因子抗体实验， 酶联免疫吸附实验（ELISA ）,实时PCR和microRNA阵列技术进行分析。在 动脉粥样硬化细胞因子抗体实验中,CD40 ,G-CSFFN-y ,L-邛,L-6 ,MCP-1 , MIP-3a , TNF-a和VEGF通过TSA减弱。在ELISA数据中，TSA处理小鼠显 示 CRP , ox-LDL , IL-lp , IL-6 , IL-12 和 TNF-a明显减少。实时定量 PCR 分 析显示在心脏和主动脉组织中，TSA减少CCL-2 , CD40 , IL-lp , IL-6

3、, TNF- a，和 MMP-2的表达。此外，肝脏CRP被TSA下调，尽管FASN和HMG-CoA 不可以。miR-146b和miR-155的相关表达通过卟啉单胞菌上调和通过TSA治 疗下调。动脉粥样硬化是世界上最常见的种多因素的致死性心血管疾病。其特征是内膜 内的脂质沉积和炎症反应。炎症和氧化应激被认为在动脉粥样硬化的形成和斑块 形成中起着关键作用。牙周炎是种慢性炎症性疾病，导致牙齿支持组织的破坏， 包括牙槽骨和牙周韧带的吸收，最终导致牙齿丧失。牙周炎与全身性疾病如心血 管疾病、糖尿病和骨质疏松症有关。此外，流行病学的研究表明，牙周炎与动脉 粥样硬化关系密切，与牙周致病菌与心血管疾病的发病正

4、相关。卟啉单胞菌属（P gingivalis ）是一种革兰氏阴性，无鞭毛，厌氧菌。它不 仅是与慢性牙周炎相关的最重要的病原体之一，而且也是动脉粥样硬化的一个重 要危险因素。牙龈卟啉单胞菌感染可增加炎症标志物；病原体侵入血管平滑肌细 胞和内皮细胞，促进动脉粥样硬化的进展。以前的研究已经表明， P. gingivalis 感染可激活响应 P. gingivalis 加速动脉粥样硬化炎症介质。丹参酮IIA （ TSA ）是一个从丹参中分离的主要的生物活性脂溶性成分，这 是中药丹参根（图1 ）。TSA被发现有心脏保护和抗动脉粥样硬化的作用，由于 其抗氧化，抗炎和抗脂质沉积的影响。TSA具有抗氧化作用，

5、通过减少血管氧化 应激、抑制血小板聚集和保护内皮细胞免受动脉硬化的影响。最近指出， TSA 对于动脉粥样硬化的抗炎和免疫调节作用。因此，本研究的目的是探讨TSA抑制载脂蛋白E基因敲除P. gingivalis致 动脉粥样硬化（ ApoE -/-）小鼠，并观察在血清和心脏，与动脉粥样硬化相关 因子表达的主动脉和肝脏组织，以评估可能的抗炎和 TSA 的抗氧化作用。由于 载脂蛋白 E 缺乏，先天缺陷影响脂质代谢，在某些条件下（如病原体感染）， ApoE -/-小鼠更易患动脉硬化症，这与饮食无关。由于高脂饮食可导致动脉粥样 硬化本身，正常饮食中使用这些小鼠避免混杂因素。材料和方法细菌培养 细菌培养的牙

6、龈卟啉单胞菌 FDC381 在厌氧环境下培养（ 80%氮气， 10%的二氧化碳，10%氢气）5%绵羊血琼脂平板（Oxoid公司厌氧基底，英国）在37工 3-5天。培养物接种到脑心浸液肉汤（Oxoid公司，英国）5 pg/mL的血红素 和0.4pg/mL的甲萘醌（美国），在37工生长2天直到它们达到每1.0相对应 每109CFUmL的600nm的密度。细菌悬浮再4C, 8000转20分钟并用PBS 稀释。小鼠和处理六周龄的雄性ApoE -/-小鼠（C57BL / 6）是从Vital River公司购买，（北 京，中国）和安置无特定病原体的条件下。他们用无菌蒸馏水自由采食食物。机 构北京大学医学部

7、动物保护和利用委员会批准的实验研究（批准号 la201464）。 经过2周后，将小鼠随机分为三组（n二8 /组）：（a）ApoE -/- + PBS ,（ b ） ApoE -/- +牙龈卟啉单胞菌，和（c ） ApoE -/- +牙龈卟啉单胞菌+ TSA。小鼠静 脉注射接种10次，三次周，以（a ） PBS （100微升/只）或（b ）和（c ）牙龈 卟啉单胞菌（108 CFU 100p L-1 /只）。组（C）,TSA（西格玛奥德里奇，美 国）溶于0.5%羧甲基纤维素（CMC ；西格玛奥德里奇，美国）口服灌胃剂量为 60 mg kg-1,先前所描述的。在16周的时间内，处死小鼠收集血液和组

8、织样 本。组织准备小鼠继续接受正常的食物和蒸馏水，不论是否使用TSA，直到16周龄。所 有小鼠处死腹腔注射戊巴比妥钠（100 p g p L-1,默克，德国）。血液样品经 眶下穿刺收集血清以离心分离法在10000转5分钟在4C,心脏和主动脉灌注 肝素冰PBS 0.9%左心室10分钟的心脏部件（包括主动脉根部）仔细解剖，嵌 入式OCT复合（组织Torrance, CA ,美国，德安,）,和冰冻切片。肝脏迅速从小鼠体内取出，放在液态氮中，并保持在-80C。油红O染色冰冻切片的主动脉窦进行油红O染色。测量后paigen等人的改性方法是动 脉粥样硬化病变。每一部分都被光学显微镜（尼康Eclipse C

9、I，日本）和数码相 机（奥林巴斯Q 颜色5，日本）捕获。总皮损面积和主动脉管腔病变每段所占 百分比（ 5 微米厚）采用 Image-Pro Plus 6 软件计算（ Media Cybernetics ， 美国）。15 部分为动物的值的平均值，表示为每段每只动物的主动脉管腔病变 占百分比。抗体实验血清样品用小鼠动脉粥样硬化抗体芯片C1分析（RayBiotech，美国），由22 个不同的动脉粥样硬化相关细胞因子抗体，按照制造商的建议如先前所描述的。使用vilber lourmat融合FX系统测定点的信号强度（Marne la Vail Cedex， 法国）以小鼠动脉粥样硬化因子定量分析软件。六个

10、阳性对照点用于确定膜的方 向，并使不同膜的结果正常化（表1）。每个点的净光密度水平是从总的光密度 减去背景光水平来确定的，每个细胞因子的水平代表阳性控制的百分比。检查细 胞因子的列表见表1。细胞因子 ELISA酶联免疫吸附试验（ELISA ）试剂盒定量血清白细胞介素-1（ IL-1）、白细胞介 素-6（ IL-6 ）、肿瘤坏死因子（TNF- a）（ RayBiotech美国）；白细胞介素-12 （IL-12）（ eBioscience、美国）；和C反应蛋白（CRP）（慈生物科技公司， 美国）。ELISA试剂盒也被用来量化氧化低密度脂蛋白（LDL ）（ Cusabio，中 国），高密度脂蛋白（H

11、DL ）（慈生物科学，美国），和低密度脂蛋白（LDL） 和极低密度脂蛋白（VLDL ）（慈生物科学，美国）。定量实时 PCR从心脏、主动脉纯化总RNA，用试剂盒提取肝组织纤维组织（Qiagen公司， 美国）和试剂加试剂盒（ Qiagen 公司，美国）。以下采用 PrimeScript RT Master Mix试剂盒反转录（Takara Bio，日本）产生的互补DNA（ cDNA ），实时定 量聚合酶链反应PCR ）分析使用应用Biosystems 7500快速实时PCR系统:Life Technologies，美国）按照制造商的协议。简单的反应，包含2xSYBR Green （Takara生

12、物、日本），100 nm的每个引物和30ng的逆转录的RNA。PCR 条件为95C30s , 95C5s , 60C34s , 40循环。解离曲线分析证实特异性。每 个基因测试一式三份与靶RNA水平正常化3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH ） 信使RNA （mRNA）o引物序列如表2所示。MicroRNA实验和定量实时PCRMicroRNA （ miRNA ）使用miRcute miRNA分离试剂盒分离的小鼠的心脏部 位（Tiangen、中国），根据制造商的说明。miRNA进行反转录使用mircute miRNA cDNA第一链cDNA合成试剂盒（Tiangen，中国）。miRcute miRN

13、A 定量检测试剂盒（SYBR Green、Tiangen、中国）和转录和TaqMan mRNA 的检测引物和TaqMan miR-146b miR-155 （ Tiangen、中国）用于实时定量 RT-PCR分析。反应使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行（Life Technologies，美国），并显示阈值周期（Ct） 35的患者被排除在分析之外。 通过使用snoRNA234通过2-ct相对定量方法。一种内源性miRNA控制计 算值的表达式。将miRNA的表达分析为折叠变化。统计学分析所有结果均以平均士标准差（SD ）表示。数据采用Mann-Whitney U

14、检验或方 差分析，随后Tukey Kramer多次试验分析。SPSS 16 (IBM、美国)用于分析。 P0.05 认为有显著意义。结果在主动脉窦的动脉粥样硬化斑块在主动脉窦的动脉粥样硬化斑块冰冻切片进行油红 O 染色。对近端主动脉 粥样硬化斑块占管腔的比，Pgingivalis处理小鼠比PBS接种小鼠更高(图2A ,B , PBS : 5.992.02%vs.牙龈卟啉单胞菌：10.541.78% ； P 0.01)。与此 相反,TSA处理组提出的小P. gingivalis感染引起的动脉粥样硬化斑块(图2A , B，牙龈卟啉单胞菌：10.541.78%vs.牙龈卟啉单胞菌+TSA : 8.7

15、11.66% , P 0.05)。在血清中动脉粥样硬化相关因子探讨 TSA 抑制动脉粥样硬化的进展，应用小鼠动脉粥样硬化抗体芯片 C1 测定 血清动脉粥样硬化相关因素。牙龈卟啉单胞菌的处理增加血清碱性成纤维细胞生 长因子( bFGF)( P 0.05)， CD40( P 0.01)，嗜酸性粒细胞趋化因子( P 0.01)，干扰素-Y (IFN-y )( P0.05 ), IL-1p ( P0.05 ), IL-6 ( P0.05 ),调节 活化正常T细胞表达和分泌因子(RANTES )(P 0.01)，肿瘤坏死因子(tnf- a ) (P 0.01)，和血管内皮生长因子(VEGF ) (P 0

16、.01 )与PBS接种小鼠。 bFGF 的表达( P 0.05)， CD40( P 0.01)，嗜酸性粒细胞趋化因子( P 0.01),粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(P0.05),干扰素-y (P0.01), IL-10 ( P 0.01), IL-6 ( P 0.01)，单核细胞趋化蛋白-1 ( MCP-1 )(P 0.01)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)(P0.01),趋化因子(P0.05)。与此相反，TSA 处理降低 IL-1 p (图 4A , 197.6 33.6 vs. 240.6 35 pg mL-1， Pv 0.05)，白细胞介素-6(图 4B， 191.984.3 vs.

17、287.985.5 pg mL-1 , P v 0.05 )，肿瘤坏死因子(图 4C , 630.9101.7 vs. 767.8101.2 pg mL-1 ,P 0.05 )、IL-12(图 4D , 1116 vs. 128.117 pg mL-1 ,P v 0.05 ), CRP (图 4E , 493.139.5 vs. 615.6 57.7 g L-1 , Pv 0.01)、氧化低密度脂 蛋白(图 4F， 6.40.9 vs. 7.61 molmL-1， Pv 0.05)，高密度脂蛋白(图 4g 678.3 比 57.43.9 mol mL-1 , P v 0.05 )。然而,LDL

18、 / VLDL 差异无统 计学意义(图4、牙龈卟啉单胞菌：32.45.2 mol -1vs牙龈卟啉单胞菌+TSA : 28.84.6 mol mL-1 , P 0.05 )。心脏，主动脉和肝脏组织的炎性细胞因子和氧化介质在牙龈卟啉单胞菌感染激活的动脉粥样硬化中，检查参与各种炎症与氧化介 质，在心脏、主动脉、肝组织实时定量 PCR 检测炎性细胞因子和氧化标记基因 表达。在心脏组织中，牙龈卟啉单胞菌感染升高CCL-2表达(P 0.01) , CD40(PvO.O1)L-10( Pv0.01)L-6( PvO.01),肿瘤坏死因子(P0.01), 基质金属蛋白酶(MMP2 )(P 0.01)，与MM

19、P-9 ( P 0.05 )，以及氧化 介质凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体( LOX-1)( P 0.05)和环氧化酶-2(COX-2 )(P 0.05 )，与PBS对照组小鼠。相反，该TSA处理组显著降低 (P 0.05 表达 CCL-2 )、CD40 ( P 0.05 ), IL-10 ( P 0.05 ), IL-6 ( P 0.05 ),肿瘤坏死因子(P0.05),与 MMP-2 ( P0.01)(图 5A )。在主动脉(图 5B) ,P. gingivalis诱导CCL-2表达增加(P0.01) ,CD40 (P0.01) ,IL-1p( P0.01) ,IL-6( P0.01),肿

20、瘤坏死因子(P0.01), MMP-2( P 0.05)，MMP-9( P 0.05)，LOX-1( P 0.01)，但没有 COX-2。 相比于牙龈卟啉单胞菌的处理组、TSA处理降低CCL-2表达(P0.05 ) ,CD40(P 0.05 ) , IL-1p ( P 0.05 ) , IL-6( P 0.05 ),肿瘤坏死因子(P0.05), 与 MMP-2( P 0.05)。另外虽然TSA处理显著降低牙龈卟啉单胞菌感染组CRP的表达(P0.05 ) 的活性，从肝脏样品观察牙龈卟啉单胞菌处理组和 TSA 处理之间组脂肪酸合酶 (FASN )和 3hydroxy-3-methylglutary

21、l 辅酶 A ( HMG-CoA )均无显著差异 (图 5c )。在心脏组织中的microRNA的表达ApoE 缺乏伴有牙龈卟啉单胞菌感染小鼠 miR-146b 的相对表达增加( P0.01），并下调在心脏组织TSA处理（P v 0.01 ）。同样，miR-155的相对表 达显示出牙龈卟啉单胞菌明显增加小鼠（P v 0.01），然后通过TSA显著下降（P v 0.05）（图 6）。讨论P. gingivalis 是参与牙周疾病的炎症反应的主要致病菌。牙龈卟啉单胞菌感染引 起的炎症反应，也通过损伤血管内皮细胞促进动脉粥样硬化的发展。许多研究表 明，牙龈卟啉单胞菌感染加速动脉粥样硬化的进展，在人类

22、和动物模型。此外， 研究表明P gingivalis不仅侵入血管内皮细胞但也激活免疫细胞如树突状细胞、 T 细胞和单核细胞，诱导心血管系统炎症反应。因此，目前的研究表明，牙龈卟啉单胞菌感染加速ApoE-/-小鼠动脉粥样硬 化斑块发展，并认为血清动脉粥样硬化因子bFGF、嗜酸性细胞活化趋化因子-1、 G-CSF、MCP-1、MIP、IFN-y、IL-1、IL-6、TNF-a、VEGF、CD40、和 RANTES 增加，与PBS处理小鼠相比。此外，炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF- a血清水平 和炎症标志物CRP和IL-6L-1、TNF-a、CRP、MMP-2、MMP-9、 CC

23、L-2 , CD40的mRNA表达的，在心脏和主动脉组织中牙龈卟啉单胞菌小鼠 中增加。另一方面，氧化介质ox-LDL , LDL / VLDL,LOX-1、COX-2、FASN、 HMG-CoA只是轻微上调牙龈卟啉单胞菌感染。此外对miR-146b和miR-155 的相对表达呈显著增加小鼠牙龈卟啉单胞菌。许多研究表明，Pgingivalis可以 增加炎症介质IL-1、IL-6、IL-12、TNF-a、MCP-1和加速动脉粥样硬化的发展。 牙龈卟啉单胞菌的侵袭也上调 M-CSF、 G-CSF、 IFN-y、 IL-1、 IL-13、 CD40、 RANTES、CRP、MMP-2和MMP-9 ,诱

24、导宿主的免疫反应，促进动脉粥样硬 化病变的形成。近日gingivalis已被证明在兔子模型中，通过核因子-kB（ NF KB）, P65 , p38 MAPK和JNK信号通路激活TLR-2、TLR-4、TNF-a、CRP、 IL-6、MMP-9和MCP-1表达。另一方面，一些报告表明，牙龈卟啉单胞菌加 重ox-LDL和TNF -a诱导的内皮细胞损伤和与LDL-C水平呈正相关。我们以前 的研究也表明，在 ApoE -/-小鼠中牙龈卟啉单胞菌感染与高脂饮食诱导的动脉 粥样硬化病变和高表达的炎性细胞因子和氧化介质。格罗尔在一项动物研究发 现，在主动脉高胆固醇饮食的野生型 C57BL6 小鼠，牙龈卟啉

25、单胞菌升高 ICAM-1 ,VCAM-1 丄0X-1 和 TLR4 的表达。此外卫 gingivalis 脂多糖（LPS） 增加在ApoE -/-小鼠中COX-2 mRNA的表达。总之，P. gingivalis和它的毒 力因素在炎症和氧化应激中发挥重要的作用，并且加速动脉粥样硬化的发生。丹参被广泛应用于中医对心血管疾病如心肌梗死（MI ），动脉粥样硬化和血 栓闭塞性脉管炎的治疗。TSA是丹参的的主要成分，具有抗炎、抗氧化和心脏 保护作用。药物名为傅芳丹神是中国药典上市并在慢性稳定型心绞痛患者已完 成III期临床试验的疗效和安全性（第nct01659580 ）。大多数研究揭示了 TSA对心血管

26、疾病的抗氧化作用，但对动脉粥样硬化的抗炎作用研究有限。有 了这个目标，目前的研究表明，P. gingivalis加速动脉粥样硬化的进展，而这 可以通过TSA处理防止。在这项研究中， TSA 抑制动脉粥样硬化病变的发展， ApoE -/-小鼠与减 少炎症标志物 CRP、 IL-6、 IL-1、 IL-12、 MMP-2、 MMP-9， CCL-2、 CD40、 TNF-a ，和在牙龈卟啉单胞菌攻击小鼠中，稍微降低氧化介质氧化低密度脂蛋 白、COX-2和LOX-1。先前的研究表明,ApoE -/-小鼠TSA通过下调清道夫 受体降低血清ox-LDL水平氧化低密度脂蛋白，即清道夫受体A（ SR-A ）

27、和CD36。其他研究也表明，在体内和体外实验通过减弱LDL诱导的ICAM-1 在内皮细胞的表达及MMP-9的影响稳定斑块。TSA可以下调ox-LDL通过LOX-1 表达的抑制作用，这可能有助于改善动脉粥样硬化，支持本研究。 TSA不影响血脂水平降低HDL亚组分中的水平和增加高密度脂蛋白亚组分水平。 另一方面，TSA对相关因素HMGCoA和FASN脂质合成无影响。参与调节 脂质代谢的酶有很多种，但目前仅对其中两种进行了研究。未来的工作应该研 究TSA对合成脂类的一系列综合酶的影响。血清CRP与LOX-1和氧化型低 密度脂蛋白的相互作用参与了血管内皮功能障碍，导致动脉粥样硬化的。促炎 细胞因子，如

28、TNF-a、CRP，IL-1，可以增加LOX-1表达，这也增加了牙龈 卟啉单胞菌感染和下调TSA在本研究。另一项研究表明TSA可以削弱oxLDL 诱导的内皮细胞ICAM-1和MMP-9的表达刺激的影响。我们的数据一致，TSA 调节 IL-1、IL-6、TNF-a、CD40、ICAM-1 和 VCAM-1 的表达，均由 NF-k B调节和血管内皮功能障碍的单核/巨噬细胞诱导相关。此外，徐等人还 透露，在ApoE -/-小鼠中TSA能明显抑制NF-kB的表达，以及减少炎症因 子MCP-1、IL-6、TNF-a。在H2O2损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVEC ）株 中,TSA是炎症过程的关键调节因子参

29、与动脉粥样硬化的各个阶段。在ApoE -/-牙龈卟啉单胞菌感染小鼠中通过我们的研究也证实了 IL-12和IFN-y的表 达是由TSA在LPS刺激巨噬细胞的强烈抑制。MMPs 促进炎症在受伤的血管壁的 T 细胞，巨噬细的浸润。特别是，MMP-2和MMP-9的已被确定为在动脉粥样硬化斑块形成和稳定性中主要的 蛋白酶降解胶原。 TSA 抑制高脂饮食兔动脉粥样硬化斑块中 MMP-2 和 MMP-9的表达/活性。在本研究中，我们证明TSA降低MMP-2的水平而不影响心脏和主动脉组织中 MMP-9 的表达。方等人表明在肾性高血压大鼠中 TSA在高剂量(70 mgkg-1d-1),对MMP-9基因表达产生抑

30、制作用。我 们推测，TSA 60 mg kg-1天能通过抗炎作用减轻动脉粥样硬化的发展。临床 研究报告说，心血管疾病患者血液中的miRNA水平显著改变。miR-146a / b 单核细胞表达强烈影响受炎症刺激，如通过NF-kB依赖机制LPS。研究表明 miR-146b 被内皮细胞暴露于促炎细胞因子的表达，并通过 ox-LDL miR-155 表达来调控泡沫细胞的形成；在动脉粥样硬化发展发挥了至 关重要的作用。 miR-155 表达在单核细胞显示出最明显的变化在 LPS、IFN- Y、TNF-a刺激或在一个NF-kB方式与对TNF-a的生产的作用相反。另一方 面，miR-155可以提高翻译因子通

31、过影响IKK、FADD、和RIPK1稳定转录。 两miR-146b miR-155已报道与心血管疾病相关的。因此，TSA可以发挥与 抑制 miR-155， miR-146b 水平相关的动脉粥样硬化的作用，如在本研究中 观察到的。总之，牙龈卟啉单胞菌感染引起的炎症反应，在动脉粥样硬化 ApoE -/- 小鼠起到了至关重要的作用。这可以通过 TSA 处理来预防。 TSA 降低动脉粥 样硬化进展时炎症介质的表达。TSA可通过抗炎和抗氧化作用预防病原体加速 动脉粥样硬化的发生。ARCDFFGH1POSimsWFC1NWSRl-ANKhFCSFCD4ftFaisirn-l_POSimsWFC1NWSRl

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42、by real-rime PCR. The jclativt CKprcssion of mfeR.- 146b and nniR-155 was analyzed by neaL-timc F匚R m PBS-iiwculatrd, Poipliymmonus jjjiy/ts-ctial Lciigei and TSA-trratcd mice at 16 weeks. Data arc expressed as the fuld change inrcsMis in rhe P. lenged group conipantd with the PGS-innculalcd. group, and clccrras.es in the TSA-treated group aflcr ncrniahzation tc snjRNA23_ Valu-cs represent dsc nucan SD (tr = 8J. P 0.01 Gompand with the P&S-Lnoculaicd group. *P 0.05. &.0i gdhi-pared wi Lhe P. gingival is -ch allcngcd group.