皮肤光变态反应试验方法及编制说明

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1、皮肤光变态反应试验Skin Photoallergy Test1.范围本方法规定动物皮肤光变态反应试验的基本原则、要求与方法 本方法适用于化妆品原料和产品的皮肤光变态反应检测2. 规范性引用文件 GB 14924.3-2010实验动物配合饲料营养成分 GB 14925-2010/XG1-2011实验动物 环境及设施国家标准第1号修改单 光感作性。化桩品安全性言平俩寸吝指金十2015 （日本化桩品工棠速合会褊，2015 年11月27日出版，藁事日幸艮社）3. 试验目的本试验用于评估与预测人体重复接触化妆品原料及其产品，并在日光照射下引起皮肤光 变态反应的可能性。4.定义4.1 光敏性（Photo

2、sensitivity）广义的光敏性包括光毒性（Phototoxicity，又称为光刺激性，photoirritation）与光变态 （Photoallergy ）o4.2皮肤光变态反应（皮肤光过敏反应，Skin Photoallergy）皮肤接触受试物并经过紫外线照射，通过作用于机体免疫系统，诱导机体产生光致敏状 态，经过一定间歇期后，皮肤再次接触同一受试物并在紫外线照射下，引起特定的皮肤反应， 其反应形式包括：红斑，水肿等。5. 原理皮肤光变态反应是一种细胞介导的由光激活的皮肤免疫性反应，是IV型过敏反应的特 殊类型，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的不良

3、 反应。目前较为公认的原理为：光感物质吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中 的蛋白结合成受试物一蛋白结合物，经表皮的郎罕氏细胞传递给免疫活性细胞，引起淋巴细 胞致敏等免疫反应。致敏的淋巴细胞再次接触同一抗原时释放出淋巴因子，导致一系列有害 反应。6. 试验的基本原则6.1光化学品安全性评价的一般原则化妆品原料在紫外可见（UV/VIS）光谱（290-700 nm）有吸收，具有光稳定性， 以及根据SAR结果提示具有潜在的或不良的光效应。如果某物质在290-700nm的摩尔消光系数不超过1000 L/mol. cm时，无需提供光过敏试 验的相关数据。6.2实验动物颈部去毛皮肤通过多次皮肤涂抹

4、诱导剂量的化妆品原料后（可提前给予佐剂、 皮肤损伤处理以增强敏感性）且多次暴露于一定剂量的紫外线（日光）下，诱导特定免疫系 统（诱导阶段），经过一定间歇期后，在动物背部去毛皮肤给予激发剂量的受试物后暴露于 一定剂量的紫外线（日光）下，观察实验动物并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反 应强度。6.3实验动物与饲养环境一般选用健康、成年雄性或雌性白色豚鼠，体重350500g，雌性动物应选用未孕或未曾 产仔的。实验动物及实验环境设施应符合国家相应标准。选用豚鼠维持饲料，饮用无菌纯化水， 注意以合适的方式补充适量Vc。6.4动物试验前准备试验前动物要在实验环境中至少适应3d5d。将动物随机分为受试

5、物组、阴性（溶剂） 对照组、阳性对照组，诱导接触开始24h前在动物颈部给动物备皮（去毛），避免损伤皮肤。 试验开始和结束时应记录动物体重。6.5无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察包括全身反应和局部反应，并作 完整记录。7. 试验方法根据日本化妆品安全性评价指南（2015）中“光变态反应试验”中的推荐，本试验 方法选用Adjuvant and Strip （佐剂和角质剥离）法。以下动物试验方法以Adjuvant and Strip（佐 剂加角质剥离法）为例。7.1 动物与分组动物分为受试物组，阳性对照组，阴性对照组；每组至少5只动物。如果试验目的包 含获取受试物致敏强度值，并对受试物

6、进行光变态强度的分级，则每组至少需要10只动物。 7.2剂量水平诱导接触阶段的受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度，激发接触阶段的 受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。试验浓度水平可以通过少量动物（23只） 的预试验获得。受试物、阳性物、阴性对照的诱导与激发浓度选择：通过预试验，排除原发皮肤刺激 性与光毒性后的合适的浓度。通常选取的阳性物在所选取的浓度下其致敏率应为轻度或中 度。7.3 阳性物常用较强的阳性物为四氯代水杨酰苯胺（t etracholosalicylanilide,TCSA）或其它多卤代水 杨酰苯胺（如三漠代水杨酰苯胺，3,5,4 -Tribromosalicyl

7、anilide，TBS）。弱的阳性物可选择 6-甲基香豆素、硫氯酚等。常用阳性物的溶剂为丙酮、乙醇或二者按一定比例的混合物。每次试验均需设阳性对照物组。7.4增敏剂的配制本试验以1： 1（v/v）完全弗氏佐剂（FCA）与生理盐水的混合物作为诱导阶段的增 敏剂。7.5 UV光源7.5.1光源选择通常受试物的活化吸收波长需包含在所选光源的光谱范围之内。诱导阶段与激发阶段均选择波长为320nm400nm的UVA，如含有UVB，其剂量 不得超过0.1J/cm2。7.5.2照射剂量诱导阶段与激发阶段照射剂量均设为10.2J/cm2。7.5.3强度的测定用前需用辐射计量仪在实验动物肩部（诱导阶段）、背部（

8、激发阶段）照射区设数 个点测定光强度（mW/cm2），以平均值计。7.5.4照射时间的计算：以照射剂量为10.2J/cm2为例，按下式计算照射时间。照射时间（min）=照射剂量(10200mJ/cm2) 光强度mJ/(cm2- s)x60注：1mW/cm2= 1mJ/cm2/sec7.6 试验步骤7.6.1备皮正式试验前l8-24h将动物颈部皮肤去毛，去毛面积约为2X4 cm2，试验部位皮肤 需完好，无损伤及异常。7.6.2光诱导阶段的处理在动物颈部去毛区的四角分别皮内注射0.1ml FCA与生理盐水的1:1 （v/v）混合乳 剂（只注射一次），然后在敷用区域以透明胶带粘附并揭开，反复数次以剥

9、去部分表皮角质层， 再将受试物（阳性对照组、阴性对照组则涂抹阳性物或阴性（溶剂）对照物）约0.1 ml（g） 均匀开放涂抹在去毛区，30min后用UVA进行照射（照射剂量为10.2 J/cm2，UVB剂量剂 量不得超过0.1J/cm2 （试验前用紫外辐照计在实验动物颈背部照射区域测定光强度 （mW/cm2），计算照射时间），详见图1。去角质、开放涂布受试物、紫外照射的过程每天进行一次，共计进行5次。UVAA INDUCTION PHASE (A)B INDUCTION PHASE (B)图1光诱导阶段的佐剂注射、受试物涂敷及紫外线照射示意图7.6.3 光激发阶段的处理光诱导处理完成后两周，将豚

10、鼠背部脊柱两侧皮肤区域去毛，去毛区每块面积约 为2X2 cm2,实际涂抹面积为1.5X1.5 cm2,共46块去毛区（见图2）。将动物固定，在动物 去毛区3和4涂敷0.02ml（g）受试物（阳性对照组、阴性对照组则涂抹阳性物或阴性（溶剂） 对照物）（涂抹区域见图3）。如果受试物为化妆品产品，激发阶段的最大涂敷量不超过 0.2ml（g）。30min后，颈部去毛区和左侧去毛区（1和3）用铝箔覆盖，无刺激性胶带固定，右 侧去毛区（2和4）用UVA光源进行照射。受试物涂敷剂量浓度为经过预试验得到的、允许进 行恰当评价的浓度。光源为UV-A，照射剂量为10.2 J/cm2。7.6.4观察与评分光激发阶段

11、紫外照射后的24h与48h，肉眼观察涂抹部位的皮肤局部反应，并评分。 记录光诱导阶段紫外照射后的24h，肉眼观察涂抹照射部位的皮肤局部反应，并评分。同时 观察动物的一般状态、行为、体征等。必要时可对受试物给药部位皮肤进行组织病理学检查。 根据表1对每只动物皮肤反应评分。7.6.5结果评价（1）当受试物组动物出现皮肤反应积分习时，判为该动物出现皮肤光变态反应阳 性。（2）光致敏率的计算方法为受试组动物皮肤光变态反应阳性的动物数/总动物数 *100%。根据光致敏率对受试物的光变态反应进行强度分级（表2）。（3）光变态反应试验成立的判定：每组动物数设定为5只条件下，阳性组动物中皮肤光变态反应阳性动物

12、数N1只， 且阴性（溶剂）对照组全部动物中无皮肤光变态反应阳性动物，判定该光变态反应试验系统 成立；每组动物数N10只条件下，20%W阳性组致敏率60%，且阴性对照组致敏率10% 时，判定该光变态反应试验系统成立。（4）受试物光变态反应性的判定：每组动物数设定为5只条件下，受试物组动物中皮肤光变态反应阳性动物N1只时， 或每组动物数N10只条件下，受试物组动物致敏率N20%时，判定该受试物在该浓度下具 有光变态反应性。（5）皮肤光变态反应试验应根据比较对照组和受试物组的反应进行评价。阳性结 果时应追加试验，如：与已知阳性物质的比较试验及用其他方法（不加佐剂）进行试验，其 中非损伤性试验方法有利

13、于进一步对光变态反应性进行评价。另外，光变态反应与光毒是两 类较难以仅从观察结果进行区分的反应，必要时应追加光毒性试验。图2光激发阶段受试物涂抹与紫外照射示意图表1光变态反应试验皮肤反应评分标准皮肤反应评分红斑和焦痂形成无反应0轻微的红斑（勉强可见）1明显红斑（散在或小块红斑）2中毒-重度红斑3严重红斑（紫红色）至轻微焦痂形成4水肿形成无水肿0轻微水肿（勉强可见）1中度水肿（皮肤隆起轮廓清楚）2严重水肿（皮肤隆起约1cm或以上）3最高积分7表2皮肤光变态反应试验致敏强度分级*，#致敏率（）等级致敏强度010I弱1130II轻3160III中6180IV强81100V极强*：进行致敏强度分级时，

14、每组动物数需增加到至少10只#：致敏率是反应评分为2或以上的动物数占该组动物总数的百分比，I级致敏度（弱致敏度）没有意义，在实际使用下无致敏危险。8 试验报告报告应包括如下内容：（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度；（2）实验动物的种属、品系、来源（注明合格证号和动物级别）、性别、数量；（3）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号；（4）试验方法；（5）试验开始和结束时动物体重；（6）结果：以表格形式报告各组动物皮肤反应情况和致敏率等（建议的表格形式见表3）；（7）结论。表3XXX对豚鼠皮肤光变态反应试验结果（Adjuvant and Strip法）组 别

15、动诱导阶段局部皮肤反应评分（诱导照射后24h）激发阶段观察局部皮肤数红斑（只）水肿（只）（激红斑（发照射后，h）受试物紫外照 0123 4 0123 受试物紫外照射012剂量射剂量剂量剂量ml（g）J/cm2ml（g）J/cm2阴性0.110.20.0210.224对 照 组48受 试 物 组0.110.20.0210.22448阳性0.110.20.0210.224对 照 组&48&:每组动物数为5只，阳性对照组皮肤反应强度得分N2的动物数N1只且阴性（溶剂）对照组全部动物中无皮I 物数N10只，20%阳性组致敏率60%，且阴性对照组致敏率10%时，该试验系统方能成立。第7页共12页9 试验

16、结果的解释试验结果应能得出受试物的光变态反应能力，必要时给出受试物的光致敏强度。动物试验结果只能在很有限的范围内外推到人类。引起豚鼠强烈反应的物质在人群中也可能 引起一定程度的光变态反应，而引起豚鼠较弱反应的物质在人群中也许不能引起光变态反应。“皮肤光变态反应试验”起草说明一、基本情况：光变态是IV型超敏反应的特殊类型，目前世界各国有关光变态试验尚未形成统一的评价方 法及操作规程，推荐的各种方法的敏感性差异较大，各有优缺点。ICH、欧盟（EMEA）和美国 （FDA/CDER ）在免疫毒性指导原则中均没有具体的评价光敏潜在性的常规非临床试验方法。我国已经发布的“化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究

17、技术指导原则”和“天然药物免疫毒性 （过敏性、光过敏反应）研究的技术指导原则”中对光变态的评价基本上参考国外的评价方法。推 荐采用 Adjuvant and Strip （佐剂和角质剥离）法、Harber 法、Horio 法、Jordan 法、Maurer 法、 Morikawa和Vinson法等。而化妆品安全性评价的标准、规范中尚未纳入。为满足化妆品行业发 展的需要及化妆品安全监管的需要，有必要制定规范的皮肤光变态反应试验方法作为化妆品安全 性评价中用以补充化妆品原料及产品的光安全性检测。二、起草过程：本试验方法以采标的方式进行撰写编制，在起草过程中主要参照日本化妆品工业连合会所编 写的化妆

18、品安全性评价指南2015中“光感作性”章节、美国EPA1982年编写的皮肤毒性 一书中“光变态反应试验，章节、以及我国食品药品监管总局2015年5月13日所编写的化学 药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则。在皮肤光变态反应动物试验方法的编写中，有关“化妆品原料进行光安全性评价的基本原则”、 “光变态反应的定义”、“光变态反应试验的适用范围”等内容主要参考欧洲药品审评局（EMEA） 2003年光安全性测试指南注释、ICH。试验动物的选择参照THE SCCS NOTES OF GUIDANCE FOR THE TESTING OF COSMETIC INGREDIENTS AND THEIR

19、 SAFETY EVALUATION（ 9 th revision, September 29th, 2015）。动物光变态试验（佐剂加角质剥离法）的试验条件与步骤主要依据日本化妆品工业连合会所 编写的化妆品安全性评价指南2015，美国EPA编写的光变态反应试验中相关章节、以及 引用数较多两篇核心的英文文章与1本专业书籍中相关章节。参照了 ICH2015年1月最新修订的药物光安全性评估指导原则-S10-Step 5以及欧洲药品局 （EMA）对该导则的解读，从中主要参考目前光安全性评价的策略与原则，光变态反应试验发展 的现状。同时主要参考4篇近期英文文献中报道的体外光过敏检测方法进展情况。三、制

20、定依据：本方法主要以日本化妆品工业连合会所编写的化妆品安全性评价指南2015中光变态反应 试验、EPA编写的为指导原则，具体依据如下：【1】光感作性。化桩品安全性言平俩寸吝指金十2015 (日本化桩品工棠速合会褊，2015年11月27日出版，藁事日幸艮社)【2】 Photoallegy Testing. Dermototoxicity (US EPA, 1982)【3】化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则【H】GPT4-1。国家食品药品监管总局。2015年5月13日【4】 THE SCCS NOTES OF GUIDANCE FOR THE TESTING OF COSMETIC I

21、NGREDIENTS AND THEIR SAFETY EVALUATION( 9 th revision, September 29th, 2015)【5】 ICH Guidance S10 on Photosafety Evaluation of Pharmaceuticals Step5. ICH, January 2015【6】中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则。【Z】GPT5-1。国家食品药品监管总局。2005年3月。【7 】 Guidance for Industry -Photosafety Testing, (CDER FDA US DHHS, 20

22、03)四、主要内容：本文主要从皮肤光变态试验方法所适用的范围、所引用的规范性文件试验的原理、试验基本 原则及试验所涉及的相关试验、方法、步骤等方面进行描述，主要从动物试验、人体试验两方面， 重点介绍了试验所涉及的动物选择与分组、阴性、阳性对照组的设置。同时分诱导阶段与激发阶 段，较为细致具体地描述了试验中受试物剂量设置、光源选择、紫外照射水平的选择等重要内容， 并在试验方法中对于动物备皮、佐剂注射、受试物给药与紫外线照射的流程中各环节的实验条件 与操作方法进行了细致描述。五、其他需要说明的问题目前虽然在制药行业与工业方面均有光变态反应的动物试验方法，但由于动物试验结果对人 体试验预测性不理想、

23、以及动物福利方面的考虑，美国FDA早在2003年即废除了光变态反应的 动物试验方法，而EMA、ICH也已经将重点转向体外替代方法。但动物试验仍然是进行人体光变 态反应的前提之一，对特定具有光过敏性的药品与化妆品原料的安全性评价仍具有一定意义。影响光变态反应试验结果的因素较为复杂，除受试物本身理化特性外，试验方案中受试物剂 量的设置、紫外线照射剂量的设定、诱导阶段与激发阶段的具体方案、已经是否使用佐剂的选择 有可能影响最终的结果。“光变态反应试验方法”编制说明为进一步完善化妆品安全技术法规体系，中国食品药品检定研究院组织开展了光变态反应试 验方法的制订工作。一、必要性（一）满足化妆品行业发展的需

24、要。近年来，我国化妆品生产和消费均呈现快速发展的趋势。随着化妆品行业的发展和科学认识 的提高，原有的化妆品安全评价方法在某些方面上已不能完全满足当前化妆品行业发展需要，亟 待进行补充修订。光敏性物质是指善于吸收太阳光中的长波紫外线的物质。常见的有植物性香料、动物性香料 以及染料、焦油、沥青类物质等。日常生活中经常使用的膏霜类、香水类、香粉类化妆品中含有 的香精、染发膏中含有的各种染料等就含有各种光敏性物质。在日光照射下，反复使用含有光敏 物质的化妆品、化学品有可能引起光变态反应，产生丘疹、红斑等皮肤损伤。鉴于免疫系统的复 杂性、人与动物种属间的差异以及相关检测技术发展的局限性，目前还没有行之有

25、效的可以预测 化学物质潜在致敏性的评价方法。豚鼠皮肤光变态反应试验早在20世纪70年代就已经被引入到光敏性药品的光安全评价方法 中，日本化妆品工业联合会一直也使用该方法进行化妆品原料的光安全性评价。人体光斑贴试验 目前主要用于药品的光变态性检验中。目前国内缺乏对于具有光变态反应性的化妆品原料的检验 方法。因此，将其纳入到化妆品安全性评价方法中，可进一步补充化妆品原料及产品的光安全性 评估方法。（二）满足化妆品安全监管的需要。在化妆品行业迅速发展的同时，化妆品安全事件频频发生，公众对化妆品的质量安全要求 和监管期望越来越高。一些监督过程中必需的检验检测及评价方法需要进一步明确。在我国，药品等已将

26、光变态反应试验方法纳入评价指南中，而化妆品安全性评价的标准、规 范中尚未纳入。为满足化妆品行业发展的需要及化妆品安全监管的需要，有必要制定规范的光敏 反应试验方法用于化妆品的安全性评价工作。二、编制的目标及指导原则编制目标：拟定化妆品原料光变态反应试验的规范性实验方法，为化妆品原料安全评价中光 安全性评价提供新的指导方法。指导原则：主要参照日本化妆品工业连合会所编写的化妆品安全性评价指南2015中“光 感作性”章节、美国EPA1982年编写的皮肤毒性一书中“光变态反应试验”章节、以及我国 食品药品监管总局2015年5月13日所编写的化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导 原则。结构框架以在

27、现行化妆品卫生规范的基础上进行调整，包含了范围、定义及通用技术， 本着继承发展、科学规范、与时俱进的指导原则，突出体现适用性与可操作性。三、编制要点在皮肤光变态反应动物试验方法的编写中，有关“化妆品原料进行光安全性评价的基本原则”、 “光变态反应的定义”、“光变态反应试验的适用范围”等内容主要参考欧洲药品审评局（EMEA） 2003年光安全性测试指南注释、ICH。试验动物的选择参照THE SCCS NOTES OF GUIDANCE FOR THE TESTING OF COSMETIC INGREDIENTS AND THEIR SAFETY EVALUATION（9 th revision, September 29th, 2015）。动物光变态试验（佐剂加角质剥离法）的试验条件与步骤主要依据日本化妆品工业连合会所 编写的化妆品安全性评价指南2015，美国EPA编写的光变态反应试验中相关章节、以及 引用数较多两篇核心的英文文章与1本专业书籍中相关章节。参照了 ICH2015年1月最新修订的药物光安全性评估指导原则-S10-Step5以及欧洲药品局 （EMA）对该导则的解读，从中主要参考目前光安全性评价的策略与原则，光变态反应试验发展的 现状。同时主要参考4篇近期英文文献中报道的体外光过敏检测方法进展情况。