痰标本的前处理

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1、痰标本的前处理方法消化一除菌(美国CDC建议方法)1. N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH)(使用3D培养仪，推荐)N-乙酰-L-半胱胺酸是一种黏液溶解剂，可用来快速地将痰标本消化，并除去杂菌，NaOH在 痰标本中的最终浓度为1%。在标本处理液中乙酰半胱胺酸会很快地失去活性，因此消化液应 每日新鲜配制。消化液中会含有吸附了重金属离子的柠檬酸钠，它可以使乙酰半胱胺酸失去 活性。* 所需材料N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠溶液(NALC-NaOH) 离心管， 50ml培养基：琼脂培养基，参阅书中7H-10或7H-11；蛋黄培养基，查阅Lowentein-Jensen(LJ) 或

2、美国 Trudeau 学会0.067M 磷酸缓冲液， pH6.8 或无菌蒸馏水。0.2%牛白蛋白盐水溶液 试剂准备1)将 NaOH 和柠檬酸钠混合均匀(见表一)放带有螺旋盖子的烧瓶中储存备用，当加入乙酰半胱胺酸后，此标本处理液应于24小时内使用，因为乙酰半胱胺酸久置后会失去液化活性。表一 NALC-NaOH消化处理液的配制消化液体积(ml)4%NaOH *(ml)柠檬酸钠2H2O *(ml)NALC克)5025250.2510050500.520010010015002502502.5010005005005.00* 4.0克NaOH加到100ml蒸馏水中* 2.9克柠檬酸钠2H2O(或2.6

3、克无水柠檬酸钠)加到100ml蒸馏水中2) 0.067M 磷酸缓冲液， pH6.8储存液：(a )磷酸氢二钠：将9.47克无水Na2HPO4溶解于1升蒸馏水中。 (b)将9.07克KH2PO4溶解于1升蒸馏水中。pH6.8缓冲液：将50ml (a)液与50ml (b)液混合，调整pH至6.8。加入(a)液或b液可分别增 加或降低溶液的pH值。3) 0.2%牛白蛋白液(使用3D培养瓶培养无须此试剂)2%储存液：将0.85克NaCL溶解在100ml蒸馏水中，加入2克牛白蛋白片断V,用旋涡 振荡混匀，或用磁性搅拌器轻轻搅拌混匀。用 4%NaOH 调整 pH 为 6.8，用过滤膜或 Seitz 过滤

4、除菌。0.2%应用液：将上述储存液用 0.85%无菌盐水作1： 1 0的稀释。痰标本的处理过程1 将不超过 10ml 的痰标本加入到 50ml 的塑料离心管内，加入等体积的 NALC-NaOH 溶液。 可使用同一台离心机处理多个标本（例如，同时处理8 个标本）。2 加入消化液后，旋紧离心管的盖子，用搅拌器充分混匀至标本液化为止（约5-20秒/管）， 颠倒混匀离心管，以确保 NALC-NaOH 溶液与管内标本充分接触。 注意：避免极剧烈的震动，以减少乙酰半胱胺酸的氧化及失活。3. 将离心管放室温15分钟除菌。为达到更佳的除菌效果，可将NaOH的浓度增加至5%-6%, 而不是增加标本消化处理时间。

5、4. 用无菌蒸馏水或无菌磷酸缓冲液（pH6.8）将已消化一除菌的标本稀释至离心管上50ml的标志 处，在标本离心之前减少NaOH的继续作用，防止分支杆菌被破坏。5. 盖紧盖子，旋涡震荡或颠倒混匀。6. 3000X g离心15分钟（适当RCF结合时间可获得95%的沉淀），最好使用能密封的离心杯， 以防止气溶胶播散。如无这种可密封的离心杯，可适当调整离心过程，可参照Hall的方法。7. 离心后，将上清液倒入盛有消毒剂的容器内，用侵过消毒剂的纱布擦净试管的边缘，再盖上 试管盖子。8. 在沉淀物中加入1-2ml的磷酸缓冲液（用于3D培养）或0.2%的牛白蛋白溶液（用于涂片）混 匀备用。PetrofTs

6、氢氧化钠法（NaOH）NaOH 不仅对非抗酸菌有毒性，而且对分枝杆菌也具有毒性；因此整个消化过程应严格按照要求 进行。消化液NaOH的浓度应为2%-4%，这样才能更有效的将痰标本消化及除菌。所需材料NaOH 溶液（2%-4%）2N盐酸（HCl）溶液或盐酸-酚红指示剂（HCl-phenol red）试剂准备NaOH将2克NaOH （或4克）溶解在100ml蒸馏水中，使之成为2% （或4%）的浓度，高压灭菌。2N HCl将33ml浓HCl缓缓加入到200ml水中（注意应将酸加到水中，无将水往酸中加），高压灭菌。 酚红指示剂将20ml酚红溶液（4%NaOH中加0.4）和85ml浓HCl加入到蒸馏水中

7、，使最终体积为1000ml. 注意：酚红溶液也可单独使用。痰标本处理过程1）将10ml标本加到50ml刻度的带螺旋盖子的试管中。加入等体积的上述NaOH溶液。2）用振荡仪充分振摇 15 分钟，如果同时能进行搅拌以利于消化，则效果更好，然后放置 15 分 钟。3）3000X g离心15分钟。4）离心沉淀后，将上清液弃去，再加盐酸。可以先加 1 滴指示剂溶液，再一滴一滴的加盐酸；也 可以直接加盐酸酚红指示剂，当指示剂的颜色由红变为稳定的黄色时，即可停止加盐酸。5）将沉淀混匀后即可接种在适当的培养基上。6）涂片、自然干燥、加热固定、染色，然后进行镜检。注意：1， 对于任何消化除菌过程，允许的污染率为5%-3%。如果污染率明显地高于 5%，则 应检查消化过程，消化不足培养物会被高度污染。消化过度会使得污染率低于 3%，并有可能 影响培养的阳性率。当这两种情况出现时，最好是对 NaOH 的浓度进行调整，而不是延长或减 少标本消化的时间。当某个病人的标本总是被污染（表明正常的消化除菌过程效果不佳），则 有必要采用特殊的方法。2，为了避免污染，在前处理过程中所有应用的试剂和器皿都需要消毒灭菌。