4.3 聚合酶链式反应技术 学案

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1、4.3 聚合酶链式反应技术 学案（含答案）第第 15 课时课时聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术学 习导航1.阅读教材 P7778 内容，掌握 PCR 技术原理。2.结合教材 P7980 内容，了解 PCR 技术的基本操作过程，讨 论 PCR 技术的影响因素。重难点击1.简述 PCR 的原理。2.了解 PCR 技术的基本操作过程并讨论 PCR 技术的影响因 素。一一.PCR 的原理的原理聚合酶链式反应简称 PCR，是一种体外 迅速扩增 DNA 片段的技术，这项技术中 DNA 复制的过程和细胞内 DNA 复制的过程是类似的，请结合已学习的 DNA 分子结构和复制的 相关知识，分析 PCR 的原

2、理。1DNA 的平面结构示意图 1 写出各个标号的名称胞嘧啶；腺嘌 呤；鸟嘌呤；胸腺嘧啶；脱氧核糖；磷酸基团；胸腺嘧啶脱氧核 糖核苷酸；氢键；碱基对；一条脱氧核糖核苷酸链。2DNA 的两条链是反向平行的，为了明确表示 DNA 链的方向， 通常将羟基末端称为 3 端；将磷酸基团的末端称为 5 端，按此原 则在图上方框内标出两条链的方向。第 1 页 共 13 页答案左链上 5 端，下 3 端；右链上 3 端，下 5 端。2 细胞内 DNA 复制条件分析条件组分作用模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板原料四种脱氧核糖核苷酸合成 DNA 子链的原料酶 解旋酶打开 DNA 双螺旋 DNA 聚合酶催化

3、合成 DNA 子链能量 ATP 为 解螺旋和合成子链供能引物 RNA 为 DNA 聚合酶提供合成的 3 端起 点 3PCR 原理与反应过程 1PCR 概念是一种体外酶促合成特定 DNA 片段的技术，它能以极少量的 DNA 为模板，在几小时内复制出上 百万份的 DNA 拷贝。2 条件及作用条件作用待扩增的目的 DNA 片段作为复制的模板 两种人工合成的单链 DNA 片段合成 DNA 时所需要的特异引物四种 三磷酸脱氧核苷酸原料耐热 TaqDNA 聚合酶酶促作用缓冲溶液反应 介质 3 反应过程变性温度上升到 9498 时，目的 DNA 双链变性解旋 为单链模板。复性温度下降到 4060，两种引物通

4、过碱基互补配对与两条单 链 DNA 结合。延伸温度上升到 72 左右，溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐 热的 TaqDNA 聚合酶的作用下。根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。循环重复上述的 3 个过程，DNA 片段被不断的扩增。若开始加入了 N 个 DNA 模板片段，理论上，循环 n 次后能获 得 N2n 个 DNA 片段。第 2 页 共 13 页1PCR 原理 PCR 反应与体内 DNA 复制的引物在化学本质上是否 相同请分析原因。答案不相同。体内 DNA 复制所需引物为 RNA 聚合酶合成的一 小段 RNA，但 PCR 反应时所用引物一般是人工合成的单链 DNA 片 段。2PCR 反

5、应过程 1PCR 反应中需要解旋酶和 DNA 聚合酶吗若需 要，则与细胞内 DNA 复制有何区别答案 PCR 反应不需要解旋酶， 但需要 DNA 聚合酶。由于 PCR 反应中需要高温使 DNA 解旋，因此 PCR 所需的 DNA 聚合酶需耐高温。2PCR 的每次循环中应如何控制温度请分析原因。答案每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最 后适当升温有利于 TaqDNA 聚合酶发挥作用。3 结合下图分析 PCR 过程中 DNA 复制的方向是怎样的答案 DNA 的羟基 OH 末端为 3 端，磷酸基团的末端为 5 端。当引物与 DNA 母 链通过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的

6、 3 端开始延 伸 DNA 链，DNA 的合成方向总是从子链的 5 端向 3 端延伸。归纳总结PCR 扩增与 DNA 复制的异同项目 DNA 复制 PCR 扩增不同点时期 有丝分裂间期或减数分裂前的间期任何时期场所活细胞内细胞外 酶解旋酶.DNA 聚合酶耐高温的 TaqDNA 聚合酶引物有转录，产生 RNA 作引物，无需人工加入无转录，无引物产生，需人工加入两种 DNA 引物特点边解旋边复制先全部解旋后开始复制缓冲液不需缓冲第 3 页 共 13 页液配制缓冲液代替细胞核液设备无控制温度变化的温控设备相同 点原理严格遵循碱基互补配对原则引物都需要分别与两条模板链 相结合的两种引物模板 DNA 的

7、两条链为模板特点半保留复制原料 游离的四种脱氧核苷酸 1 下列关于 DNA 复制和 PCR 技术的描述 中，正确的是 ADNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 5 端延 伸 DNA 链 BDNA 复制不需要引物 C 引物与 DNA 母链通过碱基互补配 对进行结合 DPCR 扩增的对象是氨基酸序列答案 C 解析 DNA 聚合酶 不能从头开始合成 DNA，故 DNA 复制需要引物；DNA 聚合酶只能从 3 端延伸 DNA 链，而不能从 5 端延伸 DNA 链；引物通过碱基互补配 对原则与 DNA 母链相结合；PCR 扩增的对象是 DNA，而不是氨基酸 序列。2PCR 技术有效地解决了因为样

8、品中 DNA 含量太低难以对样品 进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的 DNA 复制相比，PCR 可以快速扩增所需的 DNA 片段，请分析回答下列有关问题 1 体内 DNA 复制过程中用解旋酶打开双链 DNA，而 PCR 技术中的解旋原理 是_。2 此过程需要一种 TaqDNA 聚合酶，该酶是从 _中分离的。3 与普通 DNA 聚合酶相比，TaqDNA 聚合酶具有的特性是 _。4 与体内 DNA 复制相比较，PCR 反应要在_中才能进 行，并且要严格控制_条件。第 4 页 共 13 页5PCR 中加入的引物有_种，加入引物的作用是 _。答案 1DNA 的热变性原理 2 水生耐热细菌 Taq

9、3 耐高温 4 一定 的缓冲溶液温度 52 作为 DNA 复制的起点解析 1PCR 技术中用高温 使 DNA 分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是 DNA 的热变性原 理。2TaqDNA 聚合酶是从水生耐热细菌 Taq 中提取的。3 与普通 DNA 聚合酶相比，TaqDNA 聚合酶在 90 以上的环境中 不变性，具有耐高温的特性。4PCR 反应需要适宜的温度和 pH，因此 PCR 反应要在一定的缓 冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。5PCR 需要两种引物，引物的识别位点决定了 PCR 扩增的 DNA 片段。PCR 中加入的引物一般是一小段单链 DNA，作用是引导 DNA 复制，可以使游离的

10、脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为 DNA 复制的起点。易错提醒与 PCR 原理有关的三个易错点 1 酶的作用位点解旋 酶的作用是使 DNA 两条链之间的氢键断开；DNA 聚合酶与 DNA 连接 酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于 磷酸二酯键。2DNA 聚合酶和 DNA 连接酶 DNA 聚合酶是将单个核苷酸连接到 已有的单链片段的 3 端上，需要模板；而 DNA 连接酶连接的是两 条 DNA 片段的缺口，不需要模板。第 5 页 共 13 页3PCR 中的解旋过程 PCR 过程中不需要解旋酶，需要升高温度 才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA 加

11、热变性后变为单链，并未分解成单体。二二.DNA 片段的片段的 PCR 扩增和产物检测扩增和产物检测 DNA 片段的 PCR 扩增可以利用 PCR 热循环仪完成，而产物的检测则 利用琼脂糖凝胶电泳进行。阅读教材，完善下列内容 1DNA 片段的 PCR 扩增准备按照 PCR 反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上 移液用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分 混合盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁离心将微量离心 管放在离心机上，离心约 10s，目的是使反应液集中在离心管底部 反应将离心管放入 PCR 仪中，设置程序进行反应 1 加入离心管中 的物质应包括模板 DNA.Taq_DNA

12、 聚合酶.4 种三磷酸脱氧核苷酸.2 种引物.缓冲液。 2 离心管中要加入少量石蜡油，目的是防止反应溶液的挥发。 3 热循环仪的反应程序应设定为 4 影响因素在 PCR 实验中，需要扩增的 DNA 片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸 的时间越长；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择， 如果引物越短，A.T 含量越多，复性温度就越低，反之引物越长，G.C 含量越 多，复性温度就越高，这是因为 G.C 之间是由 3 个氢键连接，A.T 之间是由 2 个氢键连接。第 6 页 共 13 页5PCR 过程中，循环次数是不是越多越好答案不是。TaqDNA 聚 合酶在 PCR 扩增过程中存在

13、 1105 的出错几率，而且随着循环次数 的增加，其活性也会逐渐降低。因此，PCR 过程中，循环次数并非 越多越好，一般控制在 2535 个循环。2 扩增产物的检测 1 原理琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤 孔，带有大量负电荷的 DNA 分子在外加电场的作用下可以通过这 些滤孔向正极泳动。DNA 片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分 子的大小，因此大小一致的 DNA 分子会在凝胶的一定位置形成 DNA 条带。2 过程配制质量分数为 1 的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板在 DNA 样品中加入 0.2 倍体积的载样缓冲液混匀取 20L 加入样品孔内 80V 稳压电泳 2040min 当溴酚蓝指示剂电泳到

14、凝胶底部时，切断电 源将胶板浸入溴化乙锭溶液染色 510min 在紫外透射仪上观察电泳 条带 1 实验过程分析 1 离心的目的是什么在离心的过程中，微量 离心管的盖子为什么一定要盖严答案离心的目的是使反应液集中 在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严， 防止离心过程中脱落或液体外溢。2 在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么答案离心前 用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。3PCR 实验中使用的微量离心管.枪头.缓冲液以及蒸馏水等在 使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作答案为避免外源 DNA 等的污染。第 7 页 共 13 页2 结果检测 1 实验中为什么要测定

15、 DNA 的含量答案实际操作过 程中会有许多因素影响 DNA 含量，所以需要对 DNA 含量进行测 定。2 如何判断 DNA 扩增成功答案可以通过计算 DNA 含量来评价扩 增的效果。电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察 DNA 带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。3PCR 扩增过程可能会出现哪些异常结果答案样品产物少，或 产生新的 DNA。归纳总结PCR 扩增 DNA 片段的操作要点 1 避免外源 DNA 的干扰，所用仪 器.缓冲液.蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。2 缓冲液.酶.DNA 引物和 DNA 模板等如果长期保存，需要在 20 冰箱内保存。其中，DNA 引物和 DNA 模板要

16、避免反复冻融，否则容 易造成 DNA 的降解。3 在用微量移液管混合 PCR 反应体系的各种成分时，一定注意 避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换 一个枪头的原则。4 为防止 DNA 引物与模板 DNA 在室温非特异性结合进行 PCR 反 应，需在冰盒上混合 PCR 扩增体系的各种组分。5 为避免反应过程中高温使 EP 管中的水蒸气溢出管外而导致 PCR 过程中各种成分的浓度发生变化，需在 PCR 反应过程中加入无 菌的石蜡油防止溶液的挥发。第 8 页 共 13 页3 使用 PCR 仪具体实验操作顺序应为设计好 PCR 仪的循环程序 按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心

17、管中依次加入各组 分进行 PCR 反应离心使反应液集中在离心管底部 ABCD 答案 C 解析 PCR 反应的操作步骤一般分为准备包括配制配方中的各组分并放于 实验台上移液混合离心反应。PCR 仪是一种自动控制温度的仪器， 设计好循环程序就可以进行反应了。4 近 20 年来，PCR 技术聚合酶链式反应成为分子生物学实验 室的一种常规实验手段，其原理是利用 DNA 半保留复制，在试管 中进行 DNA 的人工复制如图，在短时间内，将 DNA 扩增几百万倍 甚至几亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生 物体。1 加热使 DNA 双链间的_键完全打开，称为 _；而在细胞中是在_酶的作用下进行

18、 的。2 如果只需要大量克隆模板 DNA 中间的某个特定区段，应该加 入_种特定的引物。当温度降低至 40 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位 置结合，在 DNA 聚合酶的作用下，只能在引物的_端连接脱 氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 _。第 9 页 共 13 页3PCR 技术的必需条件，除了模板.原料.酶之外，至少还有三 个条件，即液体环境.适宜的_和_，前者由 _自动调控，后者则靠_来维持。4 通过 PCR 技术使 DNA 分子大量复制，如果将一个用 15N 标记 的 DNA 分子放入试管中，以 14N 标记的脱氧核苷酸为原料，连续 复制四次之后，则 15N 标记的 DNA 分子占全

19、部 DNA 分子总数的比 例是_。答案 1 氢解旋解旋 2 两 3 从子链的 5 端向 3 端延伸 3 温度酸 碱度 PCR 仪缓冲液 48 解析 1PCR 技术利用热变性原理使 DNA 双链 之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使 氢键断裂。2PCR 分为三个基本反应步骤变性 9498.复性 4060.延伸 72，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增 DNA 序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由 于 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从引物的 3 端延伸 DNA 链，则 DNA 的合成方向总是从子链的 5 端向 3 端延伸。3PC

20、R 技术 与细胞内的 DNA 复制不完全相同，除了需要模板.原料.酶以外， 至少还需要液体环境稳定的缓冲溶液，每一个步骤需要适宜的温 度和酸碱度等。4 一个 DNA 分子连续复制四次之后，形成 16 个 DNA 分子，15N 标记的 DNA 分子有 2 个，则 15N 标记的 DNA 分子占 全部 DNA 分子总数的比例为 8。1PCR 技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找 CTaqDNA 聚 合酶具有耐热性 D 快速.高效.灵活.易于操作答案 D 解析 PCR 技术第 10 页 共 13 页最突出的优点是快速.高效.灵活和易于操作；TaqDNA 聚合酶具有 耐热性是实验操作成功的关

21、键。2 符合 PCR 反应条件的一项是稳定的缓冲液环境 DNA 模板合成 引物四种脱氧核苷酸 DNA 聚合酶 DNA 解旋酶限制性内切酶温控设 备 ABCD 答案 D 解析 PCR 反应模拟的是生物细胞内 DNA 复制的条 件，只是无需解旋酶可热变性，也不需要基因工程的工具酶限制 性内切酶。3 下列关于 PCR 的描述中，正确的是 PCR 是一种酶促反应引物 决定了扩增的特异性扩增 DNA 利用了热变性的原理扩增的对象是 氨基酸序列 ABCD 答案 D 解析 PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的 技术，在高温条件下，把 DNA 的双链打开，缓慢冷却后，又重新 结合，需要耐高温的 DNA

22、聚合酶，同时，还需要引物，从引物的 3 端连接脱氧核苷酸。4 下图所示为 PCR 扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产 物 A第一次循环 B 第二次循环 C 第三次循环 D 第四次循环答案 A 解析在 PCR 反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的 DNA 为模板，两条 DNA 链可分别由引物和引物与其结合并在 DNA 聚合 酶的作用下延伸，所以形成的 DNA 中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的 DNA 分子又可作为模板参与反 应，所以会形成 DNA 分子两端均含引物的情况，如下图所示，因 此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。第 11 页 共 13 页5 聚合酶链式反应

23、PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。 请回答下列问题 1DNA 的两条链是反向平行的，通常将 _的末端称为 5 端，当引物与 DNA 母链通过碱基互补 配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的_开始延 伸 DNA 链。2PCR 利用了 DNA 的热变性原理解决了打开 DNA 双链的问题， 但又导致了 DNA 聚合酶失活的新问题。到 20 世纪 80 年代，科学 家从一种 Taq 细菌中分离到_，它的发现和应用 解决了上述问题。要将 Taq 细菌从其他普通的微生物中分离出 来，所用的培养基叫_。3PCR 的每次循环可以分为_三步。假设在 PCR 反应中，只有一个 DNA 片段作为模板，

24、请计算在 5 次循环后， 反应物中大约有_个这样的 DNA 片段。4 简述 PCR 技术的主要应用 _ 要求至少答两项。答案 1 磷酸基团 3 端 2 耐高温的 TaqDNA 聚合酶选择培养基 3 变性.复性和延伸 324 遗传疾病的临床诊断.法医鉴定.古生物学. 基因克隆和 DNA 序列测定等解析一条脱氧核苷酸链一端是游离的第 12 页 共 13 页羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是 3 端，含磷酸 基团的是 5 端。引物的 5 端与模板链的 3 端结合，然后沿着引物的 3 端延 伸。耐高温的 TaqDNA 聚合酶的发现是实现 PCR 的关键，该酶可以 利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR 一次循环要经历变 性.复性和延伸三个阶段。第 13 页 共 13 页