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1、酸奶中乳酸菌的筛选试验一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法二、实验原理：市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛 奶中乳糖发酵成乳酸 ，此外酸奶中还含有其他球菌，利用 它产酸等 性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加 蛋白 胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵 糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸 锰、亚硫酸铁、吐温-80 和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生 长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固 剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长， 对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的 碳酸钙形成透明圈，作为分
2、离鉴别的依据。.筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含 CaCO3 的 培养基上产生 CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细 菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入 CaCO3 的作 用是：鉴别能产生酸的细菌；中和产生的酸，以维持培 养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离三、实验药品及仪器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc3H2O、MgSO47H2O、 MnSO4H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、 蒸馏水。仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、
3、电子天平、 离心机四培养基类型 改良 MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏 10g ， 蛋白胨10g,酵母膏5g,葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml （它是 一种很好的乳化剂和分散剂 也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀 就 是对营养成分的再一次优化）K 2HPO4 2g, NaAc3H2O 5g 柠 檬酸二铵 2g，MgSO47H2O 0.58g， MnSO4H2O 0.25g，补 蒸馏水至1000ml （固体培养基中加琼脂1.5%-2%），调pH 至 6.40.2, 121 C 高压灭菌 15min改良MC培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g,蛋 白胨5g,酵母膏5g
4、,葡萄糖20g,乳糖20g, CaCO3 10g, 琼脂20g，中性红0.05g （指示剂），最终pH6.50.2,补 蒸馏水至1000ml, 121C高压灭菌15min。配制方法： 1 把除 CaCO3 以外的成分称量溶解后.调 PH 至6.2 6.4；2. 称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液；3. 将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌；4. 倒平板前,待培养基融化冷却后,平板上加入一定量的CaCO3 乳浊液,晾干了以后再接种。1、2、3、4、吸取酸奶 1ml五、实验流程10 倍梯度稀释平板涂布（改良 MC Medium）厌氧培养（28 C培养48h）待形成菌
5、落挑取溶钙圈较大的单菌落观察、记录菌落形态与特征5、Improved MC Medium 划线分离纯化6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色7、革兰氏阳性菌（G+菌）记录菌株细胞形态9、MRS液体培养（37 C培养48h具体步骤：（ 1）按要求做好培养基（ 1）无菌操作将经过充分摇匀的检样 20mL ，放入含有 180mL 灭菌生理盐水的灭菌三角瓶内，振摇均匀，即为 1：10 稀 释液，依次做1: 100、1： 1000稀释。10倍梯度稀释至10-6浓度（2）取每个稀释度的溶液2 mL分别倾倒在准备好的改良MC培 养基上，每个稀释度两个平板，用涂步环涂布，用石蜡油密 封培养基厌氧培养，42C培
6、养48h（ 3）待形成菌落后，选取表面湿润、形态饱满、溶钙圈较明显较 大的单菌落（图2-12）在改良MC培养基上进行划线纯化（ 4 ）划线纯化后挑取溶钙圈较大、形态饱满表面湿润的单菌落进 行接种试管斜面6个，试管口用石蜡封口，37C厌氧培养18 小时。（5）从试管上取单菌落进行革兰氏染色，确定是否为G+ 涂片固定 染色：初染（结晶紫染色液染色2-3分钟，用蒸馏水冲洗）媒染（碘液1-2分钟水洗）脱色（用95%乙醇冲洗 玻片2-3次，然后用蒸馏水冲洗） _复染（番红,后水洗） 镜检：在显微镜下画出菌体形态特征，确定是否为纯菌株（6）把试管里的菌体用接种环转移到已配置好的改良MRS液体 培养基上，三角瓶要用石蜡密封，37C培养恒温培养48小时。（7）取菌株培养液用离心机离心分离，3500r/min,15min，收集菌体 六、注意事项：1菌体的厌氧培养2菌分离筛选的传统步骤是先用改良 MC Medium 进行鉴别分离，再以 MRS 培养基培养六、实验结果: 绘制乳酸菌在电镜下的图片，记录乳酸菌单菌落形态特征。
乳酸菌的提取和鉴定
