乙型肝炎感染者肝门淋巴结内HBVDNA存在形式实验观察

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1、中文摘要【Ei的】 检测乙型肝炎病毒感染者肝门淋巴结内HBV DNA 租! HBV cccDNA及乙肝表面抗原,明确肝门淋巴结内HBV的DNA分予存在形 式及乙 肝表面抗原表达情况,探讨肝门淋巴结内HBV在肝移植术后乙肝复发过 程V 一的作用。【方法】实验分为三部分。第一部分:建:蓝检测肝门淋巴结内HBV DNA不U HBV cccDNA的检测体 系。根据入组病例的种族和地理分布特点,在GenBank选取HBV的B型、C型 全基因序,对比序列差异,在S区、C区、X【夏内选择相对保守的区域各设计 对巢式或半巢式引物,当样本在两个或三个区域为阳性时,认为该样本HBV DNA为阳性;根据cccDNA

2、的结构和生物学特点,利用PSAD消化去除 rcDNA和整合型HBV DNA的干扰后,利用跨越缺口的选择性引物扩增。 以pCPIO质粒为 阳性对照,对肝组织样本DNA提取样本进行检测，确定引物 的最佳退火温度和检测灵敏度。第二部分:慢性乙型肝炎相关肝移植受者肝门淋巴结的检测。选取病例为 2010年6月至201 1年3月因乙肝相关性终末期肝病于我院行肝移植手术患者共 36例,其中男性32例，女性4例,年龄4065岁,平均54. 46. 8岁,所 有患 者均为血.消HBsAg阳性且HBVDNA定量检测阴性(小于!00IU / mL为的检测 下限)。利用第部分创建的方法,检测肝I、j淋巴结内的HBV

3、DNA及cccDNA。第三部分：HBsAg阳性肝移植供者肝门淋巴结的检测。2010年6月至2011年7月,摘耳义自HBsAg阳性供者的肝门淋巴结样本共9例。利用第喑B分建立的方法检测肝门淋巴结内HBV DNA和cccDNA。利用免疫组化和防联免疫吸附法测定肝门淋巴结内HBsAg的表达。实验结果采用t检验和Fisher确切概率法 分析。【结果】第一部分：成功建立了检测肝f j淋巴结内HBV DNA 和cccDNA的 PCR体系。第二:部分：36例慢性乙型肝炎移储受者中，30例HBV DNA阳性, 性 率为83. 3% (30/36), HBV DNA的r 个独。最检测区域，S区、C区和X 区刚性

4、 率分别为 86. 1 % (31/36)、86. 1 % (31/36)、66. 7% (24 / 36) 11 1? 例 HBV cccDNA天津医科入学硕十。、7:何沧文f；”性,阳性二笨47. 2% (17 /36) .埔该组病例,根据术前是否应用核昔类药物,分为川约组(22人)和末ffj 药组(14人)，其中用药组分为用药H, j-f日j3个月(14人)羽13个月(8人)两 个亚组。HBV DNA阳性率:用药组(72. 7%, 16 / 22) j未j朝药纵(100%, 14 / 14)差异无显著的统计学意义(P=0. 062),用药组t -fj药时丨、lij3个J(71. 4%,

5、10 / 14)与茎3个,j(75%, 6/8)组问差异无显著的统汁学意义(尸.000)。11BV cccDNA阳性率:用药组(22. 7%, 5 / 22)较米用药维(85. 7% , 12 / 14)51!著降低 (P=0. 000), 用药组中用药时I、nj3个月组(7. 1%, 1/14)较茎3个，j组(50%, 4/8)漫著降低 (P=0. 039).第一.v Ij分:9例HBsAg阳性肝移植供者中，7例HBV DNA阿陛，阳 性率为77. 8%, 11BV DNA三个独立检测区域,S区、C区和x区阳性率分别为 77. 8% (7/9)、77. 8% (7 / 9)、66. 7% (

6、6/9)。5 例 HBV cccDM F ! 性,阳性率 55. 6%。hbv DNA(P=O. 651)及cccDNA(尸兰. 722)阳性率与第:部无显著性差异。免疫组化结果为可观察到少量疑似阳性细胞,分布零散。乙肝表面抗原酶 联免疫:3个检测呈阳性,阳性率33. 3% (3/9),低于肝门淋巴结中HBV DNA 和HBVcccDNA的检出率。【结论】1 .成功建立了检测肝门淋巴结内HBV DNA和HBV cccDNA的PCR体 系,杂带产生较少，方法灵敏度高,可用十相关研究。2 .对HBV感染者,HBV可感染其肝门淋巴结,肝i、J淋巴结叮能为 HBV的肝外储库之+。，并可能为肝移植术后乙

7、型肝炎病毒复发的原1闰之 3 .对血清中HBV DNA滴度低于临i床检测限的慢性乙肝患者，核甘类药物 应用3个月以上可显著降低肝门淋巴结内cccDNA的检出率,表明肝移植术 前 核首类药物的应用在减少肝外HBV病寰i： -It方面是有意义的。4 .对HBsAg阳性的HBV感染者3肝f J淋巴结内乙型肝炎病海表【卤抗原的 表达可能受剑抑制，需进步扩火病例观察。关键词:肝门淋巴结乙型II-f：炎病毒乙朋：表面抗原HBVAbs trac tObjective To indent ify the molecular tbrms andexpress on sttitus olI TBV in hepa

8、tic 1 ymph nodes, and to investigate its role in HBV recui-renco in hepatitis B related 1 iver transplantation recipients by detecting HBV DNA. HBV cccDNA and HBsAg 必 13anph nodes from hepatoduodenal ligament f HBV infected paiicnls.MethodsPart 1： To establish a detection system of HBV DNA and HBV c

9、ccDNA by PCR： Based on the characteristics of racial and geographic distribution in enrolled cusear w，selected HBV genotype B. C in GenBank and compared the difference of 2ene Sequencer then designed three pairs of nested primers in three independent areas S. C and Xregion. When a sample was positiv

10、e in two。three regions, we consider the sample ls positive for HBV DNA. Accordingt.he structural and.testin 笆sensitivit v.biological characteristics of. HBV cccDNA. we firstly digested the DNA samples extracted 开 om hepatic 1 ymph nodes using PSAD enzyme, and we also designed the primers for cccDNA

11、flank the gap reg, on and the incomplete strand of DNA. pCP 1 0 pl asmi d was used as 门 posrnve control , we used ihe samples extracted from liver tissue for testin 笛 tO dLmine the best primer anneal ing temperature nd the detection ofPart 2： 36 patients (male 32，females 4, average age 54. 4 6. 8) u

12、nderwent 1iver transplantation ior hepatitis B-related enj-stage liver disease in our hospital fromJune 2010 to March 201 1 who were pos f t j ve for serum hepatitis B surface anti2en and negative 2rHBV ONA quantitative detect ion (IBV DNA and thepositive rate was 83. 3%. In three independent detect

13、ion area of HBV DNA, the positive rate in S. C and X regions were 86. 1 %(31 / 36), 86. 1%(31 /36), 66. 7% (24 / 36)respectively.positive HBVcccDNA. the posit ive rate was 47. 2%.For this populationf thirtysix - were divided into drug treatment group(22) and nondrug treatment group (1 4) according t

14、he utility of nucleoside analogues . Drug treatment group was divided into t.wo subgroups : drug treatment3 months group。4) and drug treatment3 months group (8) . The positive rate of HBV DNA： The difference was not statistically significant between drug treatment group (72 . 7 % , 16 / 22) and nond

15、rug treatment group (100 % , 14 / 14) (P=0. 062) , the dlfleience was not statistically significant between drug treatment 3 monthsgroup(7 l. 4%, 1 0/ 1 4)and drug treatment- 3 nionths group(75%, 6 / 8) in the subgroups of drug treatment group (P-1 , ooo) . The positive rate ， HBV cccDNA ： Drug trea

16、tment group(22. 7%, 5 / 22)was significantly lower than the Hondrug treatment group(85, 7%, 12/14) (P=0. 000), drugmonths group(7. 1%, 1 / 14)wassignificantly lower than drug treatmentW3 months group(50% , 4 / 8) in the subgroups of drug treatment group fP=0. 039).Pttrt 3： 7 c：asof5 were positive fo

17、r HRV DNA i n 9 HBsAgpositive liver transplantation donors, the positive rate was 77. 8%. In three independent regions HBV DNA. The positive rate in the S* C and X regions were 77. 8%(7 / 9) 77. 8% (7/9), 66. 7% (6 / 9)respectively. Five cases were positive ,IBV cccDNA, the positive【m9 was 55. 6%, H

18、epatitis B surface an t i gen enzyme1 inked imiu nosorb ent showed that： 3 -a were positive, the positive rate was 33, 3%(3 / 9), lower than HBV DNA and 11BV cccDNA detection rate。 hepatic 1 ymph nodes in this group. A scattered distribution of a small number of positive cells can be observed 丫 immu

19、nohistochemical.Conclusions1. Ti le detection system HBV DNA and HBV cccDNA by PCR was specificity, leSS sce laneous. and this met hods can be used for resesreh.2. HBV can infeet hepatic 1 ymph nodes patients with CH b, hepatic 1 yiDph拙量Virusassociated liver transplantation recipients ,4. HepatitisH

20、BsAg -positiveB virus expressionwasillllibitedinhepaticnodes1 ymphKeywo r( s： Hepatic 1 ymph note 1113VI IBsAIIBV DNA缩略语/符号说明缩略语英文名称r卜丈名称AmpAmp i c i1 i n氨常青霉素BpBase pair碱丛对CCCDNACovalently closed circular DNA共价闭合环状DNACUBChronic hepatitis B慢性乙型肝炎dATPDeoxyribonuc1eos i de tri phosphate脱氧核糖核二肾三磷酸EBEth

21、idium Bromide澳化乙锭EDTAEthylenediaminetetraacetic乙.胺四乙酸IIBHepalitis B乙型肝炎HBcAgHepatitis B cor1.2345678图2a粪磐豢瀬聲璃明黑穿糕恵!馳23 4 5 6 車8图2b图2 hbvDNA及cccDNA检测方法的验证。图2a两份肝脏样本的HBV dna 及cccDNA检测结果:M标准DNA参比物,18为扩增后产物样本, 其中 1、2 为S 区(117bp), 3、4 为C 区(112bp), 5、6 为 X 区 (204bp), 7、 8 为 cccDNA条带(311bp)。图2b同一样本不同引物扩增后条

22、带:M标准DNA参比物,18 为扩增后产物样本。1为S区外引物(320bp), 2为S区内引物(1 I 7bp), 3 为C区外引物(41 2bp), 4为C区内引物(1 12bp), 5为X区外引物(572bp), 6为X区内引物(204bp), 7为cccDNA检测外引物扩增条带(439bp) , 8为cccDNA 检测外引物扩增条带(31 bp).1. 2. 3 HBV cccDNA 的检测方 法HBV cccDNA巢式PCR的最佳退火温度见表1。如图3所示，肝组织 DNA样本和HBV DNA阳性患者血清DNA样本(1. 6X106IU/mL)在未经过PSAD消化前,巢式PCR结果均为阳

23、性,经过PSAD 消化后,肝组织DNA样本的条带变浅,而血.清DNA样本在目标条带处无条 带显 示，表明经过PSAD处理后，DNA样本中二扰HBVcccDNA检测的HBV rcDNA和整合型HBV DNA均被去除。lOOb I I3c 0匕尚斓嶙馴酪喇黔200 睇 一对 12345 N图3 BV cccDNA检测方法验证,M为标准DNA参比物,12样本,未经PSAD消化,其 中1为肝组织样本,2为HBV DNA阳性血清样本,3未点样，4、5为 使用PSAD消化后， 其中4为肝脏样本,5为HBV DNA血清样本。1. 2. 4检测方法灵敏度检测因肝门淋巴结为肝外组织,报道表明其中含有的HBV量较

24、少,要求检测方 法灵敏度高。对pCPIO质粒，依照!0倍稀释后,使用建立的HBV DNA及 cccDNA检测方法检测,结果表明当加入pCPIO质粒的量小于5copies时,检测 结果依然为阳性,表明该方法灵敏度较高,符合要求。1. 3讨论HBV在个完整的生活周期中有多种同源的乙肝病毒DNA分子存在形 式,其在细胞内最主要存在状态为存在于胞浆中的松弛环状的双链 DNA (relaxed circular DNA, rcDNA)存在于胞核内的超螺旋的共价、闭合、 环状DNA (covalently closed ci rcu lar DNA, CCCDNA)和整合入宿主染色体内的整 合性HBV D

25、NA引。其中,rcDNA可释放进入血中，cccDNA与整合性DNA只 有当肝细胞破裂时才能进入血液。hbvrcDNA通常称为乙型肝炎病毒基因组DNA,为双链缺口环型DNA, 两条链均不闭合9.负链较长,约3200个碱基,含有乙肝病毒基因组的全长基因，基本为环形，仅在DR1 处有一缺将该链分成5和3端,陵链3端为11碱基的直接重复序列称为DR1, 5端与 末端蛋白P结合。萨链彳1均一，由3j端的长短不，造成，通常为负链长度的112左右，但 5，端固定,具7r病毒负链相同的11碱基重复序列，称为DR2,其5末端附着有与负链不恒 补的寡核糖核甘酸,形成特殊的帽状结构。JF链的DR2与负链5端下游，L

26、百碱基处的序列fT： 补,该链向负链5端互补延伸,跨过负链5端与3端之间的缺口，ij 3端序列tS. b链接, 并继续延伸,从而维系了乙肝病毒基因组双链缺口环型结构.,乙肝病 毒基因组的DNA有四 个7T放的读码框架(ORFs),分别为ORF P、orf c, orfs/PreS 着口ORFx。善（【+1 ORFC 平 fORFxfLl_i二:H 同一 IjjJ 圍匡架【I，iibv cccDNA的最初的形成途径为11川：当乙肝病毒颗粒识别肝细胞后, 籍 前S1蛋白（PreSl）和前S2蛋白（PreS2）讣+细胞膜上的受体结合,吸附予 肝细胞表面i,脱去包膜进入刖:细胞内,存胞质内脱去核壳后形

27、成rcDNA,其正 链在DNA聚合酶的作刚卜.，以、p核 m唆填il缺【i, J影成全长的 rcDNA,然后被转运至核内在拓扑异构酶作厂肖F=构象。戈，H改变7影成超螺旋cccDNA。HBV cccDNA和rcDNA核酸序列具有高度的。致性。cccDNA分予可稳定的存在于被 感染细胞的胞核内I 31,是HBV感染初蠟j最先检测到的复制中间体，是HBV 侵入细胞后的在细胞内进行复制的起始步骤1 4。检测发现每个被感染肝细胞 内存 在1-50个cccDNA分子” 51,鸭乙肘模型表明,在慢性乙型肝炎不同阶段, 肝细胞内平均cccDNA分子数量发生明显改变,但其具体机制仍未阐明I 61。电 镜下的一

28、系列典型特征表明,细胞核内的cccDNA分子在非转录状态的染色质 折叠为核小体,可转化为染色体样结构，称为病毒微染色体【17L乙肝病毒的 微染色体含有组蛋白和非组蛋白,H3和H2B是最常见的组蛋白,同时含有低水 平的H4和H2A组蛋白,病毒表面的核心蛋E也是微染色体的结构成分，他能 结合到乙肝病毒的双链DNA上,使核小体体移：减少整合型HBV DNA整合入宿主基区1组的分子机制至今尚未阐明，过去的 研 究主要集中在寻找HBV DNA在宿ji染色体上的优势整合位点以及与肿瘤 发生发展相关整合靶甚因191。研究表明HB7 DNA的整合可发生在除13、X 和丫外 的所有染色体上,整合呈现多样性和复杂

29、性120J。目前多数观点认为HBV 在染色体上的整合是随机的，表现为两方面:r 1）整合到宿主细胞的HBV DNA往往 不是完整的病毒序列，在已描述的HBV DNA整合片段中未检测到两个 完全一致的序列;（2）HBV DNA整合入宿卜黎因组的部位是随机分布的121。根据HBV在细胞内的存在状态特,*,分别在HBV DNA的三个兀放渎码区S区、C区嗣I X区设计对巢式或、二巢引物，当同1样本在两个或三个独。谴的 区域检测结果为附建时,认为该样本HBV DNA为|5日性。检测位点选在HBV的 保守序列区域，可减少因HBV的变片造成的假阴性结果;进行多位,r氧的检测， 增加对整合型HBVDNA的检测

30、位点,提、五榆甘率。同时可减少因PCR技术本 身造成的假阳性结果，提髙检测结果的准f（flj性。hbv cccDNA的鉴别主!要利川cccDNA特殊的结构和生物学特点将其分 离 出来。cccDNA与rcDNA的差异i婴为（1） rcDNA在正链和负链上均有 缺口或缺刻,部分区域f f:补FJE-此叫Tr夕F成环状结构,但非超蝌旋结构,而cccDNA两条 链均是完整的, 二者共价!f:,形成超螺旋结构;(2)rcDNA能与蛋白质共价结 合,cccDNA则不能，故cccDNA分子量较大;(3)山二缺丨或缺刻的存在,rcDNA以 被一止电核酸酶如外切核酸酶!II,绿再核酸酶、PSAD等降解成寡核箭酸

31、或单核 甘酸,而cccDNA则山于是超螺旋而双链结构均完整,般不会被f：述酶降解。丨l_f前HBV cccDNA的检测方法主要为Souhternblot和选择性PCR两火类K 川。hbv cccDNA形成过程中补全了 rcDNA的缺f I,同H寸以超螺旋结构形式 存在，电泳时的运动速度较HBVrcDNA快，Southernblot就是基于这种泳动速度差异，将二:者分离、鉴别,从而用于HBV cccDNA的检测:但 Southernblot操作时需 要较多的待测DNA标本量，这在实际应用时往往难以 做到。选择性PCR技术 用于基本原理是,在设计PCR引物时,利用HBV cccDNA与rcDNA分

32、子级 结构之间的差异,使cccDNA的扩增效率显著地高 于rcDNA,从而通过其产生 的差距,判断待测标本中是否存在cccDNA。选择性PCR引物设计的基本原理如图3所示:FF义链引物P!位于 IIBV rcDNA正链5,端的上游，反义链引物P2位于负链5端的下游。当检测 样本为hbv cccDNA时，PCR反应能以其完整的1F负链为模板合成子链,币j 每轮反应所合成的子链又可成为新的模板参与此后每轮合成反应，从而 使PCR呈链式反应逐级放大，以几何级数的速率进行扩增，获得大量的预定长 度片段的产物。当检测标本为HBV rcDNA时,因rcDNA分子正负链5端 均存在缺口,使引物延伸受限无法跨

33、越缺口,造成每轮循环中产生的子链片段均短于预定的长度， 这些子链也就无法作为新的模板与对应引物结合扩增产生目标长度的产物，最终 凝胶电泳无法再目标条带处产生肉眼可辨的条带。图3 HBVrcDNA与HBVcccDNA扩增产生差距的原因,P1为正引物,P2 为负引物。但此方法在实际应用中存在缺陷，虽然每轮循环中产生的子链片段短于预 定的长度,无法作为新的模板,但HBVDNA的正负链是互补的,经PCR所合成的这些子链也是部分互补的。实际反应中,这些子链就有机会通过互补部 分彼此粘附,互为模板延伸出预定长度的产物,然后以这些产物为模板进行 PCR扩増,如图3所示。这种粘连是随机发生的，有研究表明当每个

34、PCR反 应管中hbv DNA的量在Ipg（约为6X105拷贝）时,能达到最大的灵敏度与 反应性,超过这个量,即可产生假阳性的检测结果23.同时,对于整合型 HBV DNA,这种选择性的引物设计也是不起作用的。为去除HBV rcDNA和整合型DNA的干扰，在进行PCR前,对检测样本进 行PSAD 的消化。该酶可敏感而有效的降解rcDNA的单链区和线性的整合型DNAt24j .为了验证该方法的实际效果,对高滴度的血清的检测结果证明了该方法去 除rcDNA干扰 的有效性,表明PSAD能有效去除检测中的干扰。1. 4小结成功建立了检测细胞中HBV DNA和HBV cccDNA的巢式或半巢式PCR方

35、法,经验 证,此方法准确、可靠、灵敏度高,可用于肝门淋巴结内HBV的检测。天津医科人学硕:学何论文乙7咖（一炎棚天H=移植受者肌t门淋巴结内 HBVDNA J cccDNA 的检测二、乙型肝炎相关肝移植受者肝门淋巴结内HBVDNA与cccDNA的检测2. 1材料和方法2. 1. I临床资料2. 1. 1. 1病例选择2010年6月至2011年3月因&； I-F）H关终术期Jjf病二我院行月移植F术 忠者入组36例,依据病史、查体、实验室检查、B超和CT等影像学检台结果 确定 诊断。其中男性32例,女性4例，年龄4065岁,平均54. 4 + 6. 8岁。 所有患者HBsAg和抗乙肝核心抗体（antiHBc）均为阳性,HBeAg阳性患者10例。所有患者均为首 次行原位肝移植术,有明确乙型肝炎病史,且血清中HBV dna定量检测阴性（检测下限为 小于1001U/mL）,没有合并丙型肝炎病毒（HCV）和HIV感染。其中乙型肝炎肝硬化患者1