PCR实验室污染与对策.pdf

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1、PCR实验室的污染与对策 河北医科大学第三医院 冯忠军 PCR技术是一种体外模拟自然DNA复 制过程的核酸扩增技术，该技术通过 重复高温变性、低温退火、中温延伸 等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩 增数百万倍，获得极高的检测 敏感性。 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4

2、cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文 中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾车行 驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来 的”。 PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛。 PCR专利官司斗争不断也是基于其带来的巨大 的效益。 最令人头痛的问题是易污染，极其微 量的污染即可造成假阳性的结果。 如果形成气溶胶污染而扩散，则可

3、引起 整个PCR实验室的污染。 处理方法：极其麻烦，甚至要关闭PCR 实验室。 难忘的1995年-被称之 为PCR临床检验爆炸年？ 天下大乱！ 到天下大治！ 某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所 幸的是经过一段时间的处理，最终将PCR实 验室污染排除掉了。 某实验室污染的经历 （一）实验室情况 l实验室设置 实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增 区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标 本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩 增。 l使用试剂 试剂是由国内某公司提供的乙型肝炎病毒 (HBV)荧光定量PCR试剂。证件齐全，符合国家要 求。 l操作人员 经过卫生部临检中心组织的理论和操作培训

4、 并通过考试取得合格证。 （二）污染的发现 2004年8月12日，该实验室按正常的操 作规程检测HBV DNA标本，同时设立了阴性 对照和阳性对照(均为试剂盒中配备)，扩 增结束分析结果时，发现HBV DNA所有的标 本及阴、阳性对照均为阳性，提示操作过 程中出现污染，但具体是什么原因引起的 污染还不清楚。 （三）污染源的追踪 出现污染后，工作人员首先考虑可能是 试剂的污染，更换新批号的HBV试剂重新检 测后，结果仍然为全部标本阳性。 将HBV标本拿到其他正规的PCR实验室检 测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴性 对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标本 没有被污染。 将两种批号的HBV试剂拿到其

5、他规范的 PCR实验室检测，显示试剂没有问题。 该实验室用消毒液擦拭工作台面 后，打开所有的紫外灯照射一天，将 所使用微量进样器、离心管、枪头、 手套、记号笔、记录本等都更换掉， 再将HBV标本进行检测，结果全部标本 仍然为阳性。 第2天，仍然用消毒液擦拭工作台 面后，再打开所有的紫外灯照射一天， 将HBV标本重新检测，同时设置了两个 阴性对照(A和B)。 A对照：打开试剂反应管的盖 子，在空气中暴露10 min，盖上盖 子，上机检测； B对照：试剂的反应管不开盖 子，直接上机检测。 结果：全部标本和A对照为阳 性，而B对照为阴性。 至此，虽然还查找不到污染源是什么， 但有一点可以肯定，PCR

6、实验室污染是气溶 胶扩散而引起的。 经过调查，发现污染是由于该实验室新 来了一个清洁工人，没有经过培训就直接上 岗，在打扫实验室卫生时，用扩增区的扫笤 和拖把打扫了标本制备区的卫生引起。 （四）污染的排除 在确定了污染的原因后，工作人员就开始着 手排除污染，每天都打开整个PCR实验室的门窗和 排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个 PCR实验室，打开所有的紫外灯照射。 每隔3天按上述步骤检测一次，一直这样处理 了一个多月，A阴性对照才转为阴性。 连续检测3次A和B阴性对照,每次结果都均为 阴性,才确定PCR实验室恢复正常。 PCR强大扩增能力+检测的敏感性 l经30个周期后，特定DNA片段

7、的数量在理论上可增 加109倍 l极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成 很大的问题 lPCR实验过程中，防止污染是很重要的一个工作。 应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污 染，这是造成假阳性最大的可能。 （五）体会 开始做PCR试验时，由于接受了“PCR 极易污染”这样的培训后，当然一点都不 会马虎，每次PCR都做阴性对照和阳性对照， 持续相当长一段时间内都不会发生污染。 孰能生巧之后 严谨之下的熟练？ 偷工减料，投机取巧？ 可能渐渐就对书上说的那一套不以为 然了，心里说：我在阴性对照里面吐点口 水，看你有没有阳性结果出来（不过，估 计谁也没有真这么干过！呵呵）。再后来， 有可

8、能做PCR就不再设对照了。如果在后续 工作中还没有出现什么问题，有的人便越 发对污染看的淡了。 通常我们对PCR实验室污染的预防是采 取不同操作分区进行、分装试剂、改进实验 操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭 或浸泡、紫外线照射等。而对于实验室的通 风方面没有给予足够的重视， 为了防止实验分区间之间的相互污染， 各个实验分区间都是尽可能的密闭，从而使 得实验室出现PCR产物残留污染的几率增大。 从本次PCR实验室污染排除的过程可以 看出，污染得以排除的一个关键是通风。 适当的给予实验室通风，可起到空气稀释 的作用，有利于PCR产物残留量的减少，加 快实验室污染的排除。 将该PCR实验室的教

9、训报告给大家，是 想引起各位同行对实验室通风给予足够的 重视，不要再有类似的情况发生。 “他山之石，可以攻玉” PCR实验室污染的原因 (一)标本间交叉污染: 1、收集标本的容器被污染； 2、标本放置时，由于密封不严溢于容器外； 3、容器外粘有标本造成相互间交叉污染; 4、标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪 污染导致标本间污染; 5、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或 形成气溶胶而扩散，导致污染. (二)PCR试剂的污染: 主要是由于在PCR试剂配制过程中，由 于加样枪、容器、水及其它溶液被PCR核酸 模板污染. (三)PCR扩增产物污染 这是PCR反应中最主要最常见的污染问 题.因为PC

10、R产物拷贝量大，远远高于PCR检 测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可形成假阳性. 最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染； 在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作 时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污 染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染. 据计算，一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因 而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. PCR实验室污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监 测，考虑有无污染、什么原因造成的污染， 以便采取措施，防止和消除污染. PCR实验，不在于能否扩增出目的片段 （阳性结果）来，而是在于是不是有重复 性、有没有设置对照，其实这

11、对做任何实 验都是必需的，尤其是对照。如果PCR有问 题，没有设置对照就很难分析原因，即便 是PCR扩增的曲线很漂亮，没有对照也无法 说明是不是假阳性。 但据了解，好多操作人员往往会省掉 对照。 做PCR至少要加一个阴性对照，最好再 加设阳性对照。 这样做，有利于监测反应体系各成分的 污染情况。 （一）PCR实验室设置阴性对照的独特性 阴性对照设定很有学问。每次试验过程都要设 置阴性对照。设置不同的阴性对照可以监测污染是 否发生： 1、1份阴性原血清样本； 2、1份在标本核酸提取过程中带入的一个空管； 3、仅含扩增反应混合液的对照管。 阴性原血清对照样本的功能： 监测实验室的以前扩增产物的污染

12、； 由实验操作所致的标本间的交叉污染； 扩增反应试剂的污染。 核酸提取过程中一个空管对照的功能： 1、基本功能与阴性原血清样本相同； 2、其基质为水，不含阴性原血清对照样本 中可能含有的扩增抑制物，因而对污染 的反映更为灵敏； 3、须在准备好所有其他PCR试剂以后才进行 吸加 仅含扩增反应混合液的对照管的功能： 1、监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污 染鉴别性。 2、如想鉴别实验室是否发生污染，可将一个或 多个空管打开静置于标本制备区3060分钟， 然后加入扩增反应混合液，同时以水替代核酸 样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混 合液的对照管为阴性，则说明实验室以前扩增 产物的存在。 P

13、CR反应中的对照： （1）只有master mix （2）将master mix中加入第一个房间里的水 （3）master mix中加入第二个房间的水 （4）master mix中加入处理样本时做阴性对照的水 （5）不加任何试剂和样本，只有相同体积的水。 如果（1）中有阳性反应，则是试剂污染，（2）或（3） 中有信号是各自房间中水污染，（4）中有信号是样本处理时 有污染，（5）中有信号是PCR反应过程中有污染（机器或反应 管），这样比较容易知道污染来源。 （二）阳性对照的设置 PCR反应实验室应设有PCR阳性对照，它是 PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎 理论要求的一个重要的参考标

14、志. 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经 各种鉴定是该产物的标本，强阳性对照可产生大 量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染 源。 防止PCR实验室污染的方法 一污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些 操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或 杜绝污染的出现。 （一）划分操作区，确定工作流向： 目前，PCR尚不能做到单人单管和实现完全闭 管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实 验操作在三个不同的区域内进行，各工作区要有一 定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他 两个工作区。 PCR实验要分区进行： 所有的试剂准备

15、在一个房间，在这个房间做 master mix，任何样本都不能带入这个房间。 所有的样本处理在另一个房间，做好master mix后在这个房间加样本。 PCR扩增反应另一个房间； PCR产物鉴定在另外一个房间。 所有工作按照这样一个顺序。 lPCR反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg2 dNTP 耐热聚合酶 ddH2O （二）分装试剂： PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的 超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加 样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增 后的DNA和其他来源的DNA： 1PCR用水应为高压的双蒸水； 2引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物 区配制；

16、 3引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时 间，以备发生污染时查找原因； 4. 最好预先混合所有反应成分再分装，而不是在 每个反应管分别单独加入每种试剂成分。 5、使用已分装好的单人单包装的试剂 (三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染是造成假阳 性反应的主要原因，但样品间的交叉污染 也是原因之一。 因此，不仅要在进行扩增反应时谨慎 认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有 环节都应该注意。 移液器污染是一个值得注意的问题. 尽可能用可高压处理的移液器，由于 移液器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污 染，最好使用可高压处理的移液器。 移液器的灭菌 整支移液器或其下半部可拆卸下来经高温高压

17、灭菌处理 n 121 C，1 bar，20 分钟，灭 菌完毕后，在室温下完全晾干后 再装上 如没有这种特殊的移液器，至少PCR操 作过程中移液器应该专用，不能交叉使用， 尤其是PCR产物分析所用移液器不能拿到其 它两个区。 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内 或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸 取模板核酸时要十分小心。 1、吸样要慢，吸样时尽量一次性完成； 2、吸取液体时应缓慢匀速吸取，避免液体溅到移 液器头上； 3、打出液体后拇指不应松开按钮，将吸液嘴压掉 后再将拇指松开，避免液体回吸。 4、切忌利用多次抽吸动作进行液体的混匀，以免 交叉污染或产生气溶胶污染； 5、移液器用完要放

18、到最大计量位置，防止久了弹 簧失活。 6、最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板 使用带滤芯的加样枪头 l减少PCR循环次数，只要 PCR产物达到检测水平就适 可而止. l选择质量好的Eppendorf管， 以避免样本外溢及外来核酸 的进入，打开离心管前 应 先离心，将管壁及管盖上的 液体甩至管底部.开管动作 要轻，以防管内液体溅出. 二 追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出 发，逐一分析，排除污染。 （一）设立阴阳性对照 有利于监测反应体系各成分的污染情况。 （二）环境污染： 在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又 发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能 为环

19、境污染。 环境污染中常见的污染源主要有： 1. 模板提取时真空抽干装置； 2. 凝胶电泳加样器； 3. 电泳装置； 4. 紫外分析仪； 5. 切胶用的刀片； 6. 离心机； 7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等 可用擦拭实验来查找可疑污染源。 1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可 疑污染源； 2）0.1ml去离子水浸泡； 3）取5ml做PCR实验； 4）电泳检测结果。 8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验， 仍不能查找到确切污染源，则污染可 能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的， 此时就应该更换实验场所，若条件不 允许，则重新设计新的引物（与原引 物无相关性）或者更换试剂生产厂商。 三污染

20、处理 （一）环境污染 1. 稀酸处理法： 对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残 余DNA脱嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法： 需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产 物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱 基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对 短片段效果不大。 （二）反应液污染 可采用下列方法之一处理： 1. DNase I法： PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反 应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。 该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列； 2. 内切酶法： 选择识别4个碱基的内切

21、酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择 几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加 热灭活进行PCR； 3. 紫外照射法： 未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，但是该法对 500bp以下的片段去污效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通 常为300bp左右。 多数用于临床检验的PCR试剂都使用了UNG酶 技术，以防止前一次扩增产物的污染。 UNG酶：尿嘧啶DNA糖基酶，50摄氏度，2分 钟，作用于含有dU的DNA双链或单链；然后开始 PCR反应的预变性步骤，同时UNG失活 原理：在PCR 产物或引物中用脱氧尿苷(dUTP) 代替脱氧胸苷(dTTP)。这

22、种dUTP化的PCR产物与 UNG酶一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷 酸骨架间的N-糖基键，可除去dUTP而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶 对不含dUTP的模板无任何影响。 4.使用UNG/dUTP 系统 3.其它方法 l固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质 lRS-PCR法（RNA-specific PCR） 也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板 的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而 不影响PCR的敏感性。 l抗污染引物法 首要原则 l永远要设置NTC对照 如果不能在污染出现的第一时间发现， 会导致严重的后果：一大段时间的数据不 可

23、信 l准备PCR的移液器要专用 千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的 移液器去准备PCR 体系 PCR这东西奇怪的很，让人既明白又糊 涂，没法让人琢磨透。 许多人做了几年PCR，自觉对PCR了如指 掌，信心百倍给研究生指导实验，没过多 长时间发现曾经是那样熟悉的PCR变得如此 的陌生，从此不再对外称是PCR专家， 其实，即便是天才Mullis也不会自称是 PCR专家的。 l头脑中各操作步骤要清楚，不要加错试剂； l操作的时候尽量少说话或者不说话（“装聋 作哑”），保持头脑清醒，一旦多加了少加 了某种试剂后果也可能很严重。 lPCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。 lPCR操作应戴手套并勤于更换，必要时应戴 好帽子和口罩，就像做手术一样，要有 “无菌（基因）观念”。 l试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉 于管底，减少污染手套与加样器机会。 l最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上 盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与 有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所 有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换 手套。 l防止RNA酶污染标本； l低温下操作，防降解； l试剂有致癌致畸作用，做好个人防护； l重复实验，验证结果，慎下结论； l牢记安全用电、及时关闭水龙头； l诸如此类 河北医科大学第三医院