2023年题库文档

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1、三、简答题2重组 DNA 的含义是什么?答： 将一个生物的 DNA 片段插入到一个载体中，并引入到另一生物体中进行繁殖。3 如何理解基因工程的两个特点? 答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。分子水平的操作涉及 DNA 分离、切割和连接(尚有其他一些 DNA 的修饰等)。由于体外重组 DNA 的 最终目的是要改变生物的遗传性，所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。4 在 Cohen 构建有生物功能重组体的第一步实验中，用 EcoRI 切割了 R6-5 质粒，然后转化 EcoliC600，在卡那霉素抗性子板上筛选到了 pSCl02，它是由 R6-5

2、 的三个 EcoRI 片段组成，请推测这个质粒具有什么遗传特性? 5 答：至少可说明两点：(1)pSC 102 具有复制起点，是一个独立的复制子；(2)重组 DNA 6 分子中的卡那霉素抗性基因得到了表达。四、问答题1 SN Cohen 于 1973 年构建了三个重组体，pSCl02， pSCl05，pSCl09 请说明这三个重组体是如何获得的?各说明了什么? 答：pSCl02：用 EcoRI 切割 R6-5，混合转化大肠杆菌，在卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并从该克隆中分离了重组质粒 DNA，命名为 pSCl02。该质粒是由质粒 R 6-5的 EcoRI 酶切片段、V 和在体内连接的，说

3、明可以运用体内连接构建重组体。 pSCl05：作者分别用 EcoRI 切割质粒 pSC 101、pSC 102,然后加入 DNA 连接酶 进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上筛选到 pSC 105。 说明用质粒作为载体，体外连接可得到有功能的重组体。 pSCl09：pSC 101 与 RSF 1010 的共整合，即用 EcoRl 分别切割这两个质粒，然 后在体外进行重组。说明两个独立的复制子体外重组后仍具有生物功能。2 基因克隆是如何使具有单个基因的 DNA 片段得到纯化的? 答：大分子量的 DNA 会具有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点，因此用一种限制酶解决一完整染色体

4、或整个基因组会产生许多不同的 DNA 片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当所有片段与用同种限制酶解决过的载体分子混合时(图 A14.1)，每个片段将插入一个不同的载体分子(比如一个质粒)，同样地，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细胞将只接受一个质粒 DNA 分子而筛选出的含重组质粒的每个菌贯彻际上会具有某一特异的供体 DNA 片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了，此重组 DNA 分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。第二章 限制性内切核酸酶四、简答题2说明 SangerDNA 测序法的原理。答SangerDNA 测序法是建立在两个基本原理之上：(

5、1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由 5，端向 3，端聚合(DNA 聚合酶参与了细菌修复 DNA 合成过程)；(2)可延伸的引物必须能提供游离的 3，羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的 3，羟基末端，因此会终止聚合反映的进行。假如分别用 4 种双脱氧核苷酸终止反映，则会获得 4 组长度不同的 DNA 片段。通过比较所有 DNA 片段的长度可以得知核苷酸的序列。3在酶切反映缓冲液中加入 BSA 的目的是什么?机理是什么? 4 Fredrick 和 McClarin 等用一个由 13 个碱基对的 DNA 片段与 EcoRI、反映，然后分离到酶和 DNA 共结晶的复合物，通过 X 射线分析发现了

6、什么? 5有些噬菌体和质粒经常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒尚有哪些也许的方式避免宿主的限制作用? 答：某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基，因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是克制 SAMase 的活性，该酶制造 S腺苷甲硫氨酸。某些限制酶作用时需要 S腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反映。 6某学生在用 EcoRI 切割外源 DNA 片段时，出现了星号活性，请分析也许的因素? 7在序列 5CGAACATATGGAGT-3中具有一个 6bp 的类限制性内切核酸酶的辨认序列，该位点的序列也许是什么? 8下面几种

7、序列中你认为哪一个(哪些)最有也许是类酶的辨认序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA?为什么? 9用连接酶将 Sau 3AI(,bGATC)切割的 DNA 与经 BamHI(G GATCC)切割的 DNA 连接起来后，可以被 BamHI 切割的机率有多大(用比例表达)? 10用 Klenow 酶填补的办法可使 5黏性末端转变成平末端。这种方法常使 DNA 上的某些限制酶的辨认位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法解决会不会使它们的辨认序列都消失?BamH I(G GATCC)；Taq I(T CGA)，BssH(G CGCGC)。 11请推测细菌的染色体上是否会有

8、编码辨认 8 个碱基的内切酶? 如何验证? 12当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采用什么措施? 为什么? 五、问答题 1 什么是细菌的限制修饰系统(restriction-modificationsystem，R-Msystem) 答：细菌中有作用于同一 DNA 的两种酶，即分解 DNA 的限制酶和改变 DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。 并且，这两种酶作用于同一 DNA 的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。 2 细菌的限制修饰系统有什么意义? 3 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 4 I 类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用?

9、 5 类限制酶有哪些特点? 答：类酶是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于 I 类酶，作用方式基本 同类酶。如 EcoPI 是由两个亚基组成，一个亚基(M 亚基)负责位点辨认和修饰， 另一个亚基(R 亚基)具有核酸酶的活性。切割 DNA 时需要 ATP、Mg2+，也能被 SAM 激活，但并非必须。 6 何谓限制性内切核酸酶的切割频率? 7 什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 8 双酶消化法(doubledigests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。 答：双酶消化法是绘制 DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化

10、 DNA 分子的基础上，然后再用这两个酶同时或先后消化此 DNA，根据它们的结果，构建物理图谱。 9 什么是 DNA 多态性(DNApolymorphism)? 答：在正常人群中，各个体 DNA 分子的某些位点可以发生中性改变，这些改变虽然会使DNA 一级结构产生一定变化，但不影响基因的表达，假如这种中性突变在人群中的频率不低于 1，这一现象被称为多态性。DNA 多态性本质上是染色体 DNA 中核苷酸数目或排列顺序的个体差异，这些差异多数为中性突变，不引起表型改变。 10限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)。 13为什么大

11、多数内切酶被称为“限制”酶。答：大多数内切核酸酶是限制性的内切核酸酶，只在特定的位点(即一段特定的核酸序列或甲基化核苷酸)作用。此外，限制性内切核酸酶重要是用来切割外源片段(例如侵染的噬菌体 DNA)。噬菌体对宿主具有专一性，由于在其他生物中，其 DNA 会成为细胞限制系统袭击的对象。从这种意义上说是内切核酸酶限制了噬菌体的宿主范围。 14据 Science 杂志报道：一种重要的遗传疾病可由导致 DNA 中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。 四、简答题 3 答：目的是保护酶活性，机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活。 4答 发现：具有活性的

12、EcoRI 是一个二聚体，它们同 DNA 结合形成一个直径为 50A 的球形结构，两个 EcoRI 位于 DNA 的两侧。 6 答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。 7 答：回文序列是：5-CATATG-3 8 答：GATATC；AAATUF，由于它们是回文序列。 9 答：25。 10答：BssH不会。 11答：关于这个问题没有明确的答案。这些酶的作用不仅仅限于噬菌体的感染，由于大多数噬菌体并不具有 8 个碱基序列的酶切位点，一种也许是 8 个碱基的酶是质粒整合后加上去的，作为质粒附加系统的一部分。 12答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶

13、失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。五、问答题 1 2 答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将 DNA 中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身 DNA 上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的 DNA 在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的辨认来分辨敌我，并将人侵的外来 DNA 分子降解掉。所以 DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。 3 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。基本原则： 34 个字母组成，方式是：属名+

14、种名+株名+序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶坝，j 取词头后的第一字母代替。第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据本来的情况而定，但用正体。顺序号： 若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以 I、等，用正体。4 答：I 类限制性内切核酸酶的分子量较大，一般在 30 万道尔顿以上，通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性内切核酸酶 EcoB 是由 R(135kDa)，M(62kDa)和 S(55kDa) 三种亚基组成的复合酶，这三个

15、亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为 449kDa，共 5个亚基，其中 R 亚基和 M 亚基各两分子。I 类酶不仅是一种内切核酸酶，同时在酶分子上还具有甲基化酶和 ATPase 的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要 Mg2+作辅助因子外，还规定ATP 和 S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。I 类酶具有特异的辨认序列，大约 15 个碱基对。I 类酶虽然可以在一定序列上辨认 DNA 分子，并能同 DNA 分子作用，因其辨认DNA 后，要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为 1000 个碱基左右)，并且要形成一个环才干切割 DNA，所以辨认位点和切割位点不一致，产生的片段较

16、大。因此在基因工程中作用不大。5 6答：切割频率是指限制性内切核酸酶在某 DNA 分子中预测的切点数。由于 DNA 是由4 种类型的单核苷酸组成，假定 DNA 的碱基组成是均一的，而限制性内切核酸酶的辨认位点是随机分布的，那么对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为 14n，n 表达该限制酶辨认的碱基数。如辨认 4 个碱基的限制酶，其切割频率应为每 256 个碱基有一个辨认序列和切点(144=1256)，辨认 5 个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每 1024 个碱基有一个辨认序列和切点，余类推。7 答：类限制酶虽然辨认和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环

17、境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，辨认的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表达，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量5，vv)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(100Ug DNA)；(3)低离子强度(25 mmolL)；(4)高 pH(8.0 以上)；(5)具有有机溶剂，如 DMSO，乙醇等；(6)有非 Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+，Cu2+C02+，Zn2+等)。 10答：当 DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的辨认位点时，或当 D

18、NA 片段的插入、缺失或反复导致基因组 DNA 经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA 多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。14答：这规定基因座已被作图，其目的在于分离基因，测定核苷酸序列以及拟定是否碱基替换突变。碱基替换突变可以改变 DNA 修饰酶(例如甲基化酶、限制酶)的辨认序第三章 DNA 和 RNA 合成修饰酶四、简答题 1 按适当的顺序，列出将一种 mRNA 的 cDNA 克隆到表达载体所用到的酶。2 为什么反转录酶在聚合反映

19、中会犯错? 答：由于反转录酶缺少在 Ecoli DNA 聚合酶中起校正作用的 3- 5外切核酸酶活性，所以聚合反映往往会犯错，在高浓度的 dNTP 和 Mg2+下，每 500 个碱基中也许有一个错配。 3 什么是测序酶(sequenaseTM)? 4 什么是 S1 核酸酶作图(S1nucleasemapping)? 5 基因工程中，为什么不喜欢用 BAP 来脱去 DNA 的 5端的磷酸基团? 6 RNaseA 和 RNaseH 在催化活性和应用上有何不同? 7 切口移位(nick translation)标记 DNA 前，用 DNaseI 解决 DNA 时，应注意什么? 8 核酸酶与外切核酸酶

20、用于系列缺失突变有什么不同五、问答题 2简述 DNA 和 RNA 连接酶的催化反映机制。 3影响 DNA 连接酶催化连接反映的因素有哪些? 4什么是 Klenow 酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用? 5如何运用 T4DNA 聚合酶制备 3隐含末端或双链平末端? 答：T4DNA 聚合酶具有 5 3聚合酶和 3 5外切核酸酶两种活性，在无 dNTP 时，该酶只有 3 5外切核酸酶活性；如只有一种 dNTP(如只有 dATP)，链的 3端的降解则到出现该碱基(A)为止。这可使降解反映得到控制，产生一定长度的 3隐含 末端；当有 4 种 dNTP(且浓度较高)时，则产生 3平末端的 DNA。无论

21、是降解还是合成反映，都是两侧同时进行。6如何运用 T4DNA 聚合酶进行双链 DNA 的 3，末端标记? 答：一方面运用 T4 DNA 聚合酶的 3 5外切核酸酶的活性在缺少 dNTP 的条件下切割双链 DNA，产生突出的 5末端，然后加入放射性标记的 dNTP,运用 T4DNA 聚合酶的 5 3合成酶的活性进行填补合成，得到两端的 3端都是标记的双链 DNA 分子。假如被标记的双链 DNA 中有限制性内切核酸酶的切割位点，则可以得到两段放射性标记的探针。7如何运用 T4DNA 聚合酶制备平末端？答：可用 T4 DNA 聚合酶将任何形式的双链 DNA 转变成平末端的双链 DNA。虽然Kleno

22、w 酶可以进行这种反映，但是 T4DNA 聚合酶是更好的选择，由于 T4DNA 聚合酶的 3 5外切核酸酶的活性比 Klenow 酶强得多，并且在高浓度的 dNTP 存在时，降解作用即会停止。根据这样一种特性，可以调整反映条件，用 T4DNA 聚合酶的 3 5外切核酸酶的活性将具有 3突出末端的双链 DNA 切成平末端；用 T4 DNA 聚合酶的 5 3合成酶的活性将具有 5突出末端的双链 DNA 填补成具有平末端的双链 DNA。 8反转录酶有两种类型，一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV，avian myeloblastosis virus)，另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M-MLV,

23、Moloney murine leukemia virus)，它们之间有什么不同? 9与 EcoliRNA 聚合酶相比，细菌噬菌体的 SP6RNA 聚合酶、T7RNA 聚合酶和 T3 RNA 聚合酶具有哪些优越性? 10什么是多核苷酸激酶的向前反映和互换反映? 11细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途? 12外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用? 13Mn2、Mg2对 DNaseI(deoxyribonucleasel)的活性有什么影响?DNaseI 在基因工程中有什么作用? 14比较 S1-Mapping

24、和 Footprinting 在原理上、方法上、应用上海何不同?答 (1) 反转录酶以 mRNA 为模板复制出单链 cDNA；(2) DNA 聚合酶以单链 cDNA 为模板合成双链 DNA；(3) S1 核酸酶切割双链 DNA 形成平末端；(4) 用限制性内切核酸酶切割载体； (5) 用 DNA 连接酶将 cDNA 插入载体中。3 答：所谓测序酶即是修饰了的 T7 DNA 聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去 28 个氨基酸，这样使 T7 DNA 聚合酶完全失去了 3 5的外切核酸酶活性，只有 5 3聚合酶的活性，并且聚合能力提高了 39 倍，测序时常用此酶。4 答：S1 核酸酶

25、作图是一种对 RNA 转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。5 答： 由于 BAP 耐热和耐酚抽提。6 答：RNaseA 切单链 RNA，RNaseH 切 DNA-RNA 中的 RNA。7 答：应注意 Mg2+离子浓度和解决时间及温度。8 答：Bal31 核酸酶是对称缺失，而外切核酸酶是不对称缺失。五、问答题2 答：所有已发现的 DNA 连接酶以及 RNA 连接酶在作用过程中都形成两种以共价键相接的中间产物，即：(1)酶与 AMP 的络合物(E-A)；(2)底物与 AMP 的络合物(DNA-A)。催化反映分三步进行： 酶核苷酸中间产物的形成：将 NAD 或 ATP 的腺苷酰基团转到连接酶的赖

26、氨酸残基的-NH2 上形成酶核苷酸中间产物，假如辅助因子是 NAD，另一个产物就是 NMN，若是用 ATP 作为辅助因子，另一个产物就是 PPi； 腺苷酰基团被转移到 DNA 末端的 5-P，将 DNA 缺口的 5端激活； DNA 缺口的 3-OH 同激活的 5-P 形成磷酸二酯键，释放出 AMP。3 答：影响 DNA 连接酶催化连接反映的因素有很多，但温度对连接反映的影响较大。黏性末端链通常以 1215最佳，这种温度有助于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会减少连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，由于平末端连接不存在 DNA 的退火问题，但是温度高于 30，连

27、接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高 10100 倍。DNA 中有残存的 tRNA 不会克制 DNA 连接酶的活性，但是，假如 NaCl 的浓度高于 150mmolL，则对连接反映有强的克制作用。此外反映体系中有 NH4+离子的存在，对 Ecoli DNA 连接酶具有激活作用。EcoliDNA 连接酶需要 NAD+作辅助因子，而 T4DNA 连接酶需要 ATP。4 答：Klenow 酶是 1974 年 Klenow 用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA 聚合酶 I，得到两个片段，其中大片段的分子量为 75kDa，它具有 5 3聚合酶和 3 5外切核酸酶的活性小片段具有 5 3

28、外切核酸酶活性。由于大片段失去了 DNA 聚合酶 I 中会降解 5引物的 5 3外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow 酶重要有下列用途： (1)修复反映，制备平末端可用 Klenow 酶修复限制性内切核酸酶或其分方法产生的 5或 3突出末端，制备平末端，这样可以使本来具有不相容的黏性末端的 DNA 片段通过平末端重组。如在反映系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3末端标记的探针。用 Klenow 酶修复 5突出末端的反映重要是运用了 Klenow 酶的 DNA聚合酶活性，是填补反映；而修复 3突出末端则是用 Klenow 酶的 3 5外切核酸酶

29、的活性，是切割反映。用 Klenow 酶的切割反映来修复 3突出末端是不抱负的，改用 T4DNA 聚合酶或其他的酶是更好的选择。(2)标记 DNA3突出末端(protmding end)该反映分两步进行：先用 3 5的外切核酸酶活性除去 3突出末端，产生 3隐含末端，然后在高浓度的标记底物(32p_dNTP)存在下，使降解(3 5)作用与聚合(5 3)作用达成平衡。这种反映也叫互换或取代反映(exchangereplacementreaction)。但是这一反映用 T4DNA 聚合酶的效果更好，因它的 3 5外切核酸酶活性较强。(3)其他的一些用途：涉及用双脱氧末端终止法进行 DNA 序列分析

30、、用于 cDNA 第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链 DNA 探针等。 8 答：(1)AMV 反转录酶是一个二聚体(62kDa，94kDa)，具有 5 3合成酶和很强的 RNase H 的活性。M-MLV 反转录酶是一条多肽链，分子量为 84kDa 具有 5 3合成酶和较弱的 RNaseH 的活性。当用长的 RNA 合成互补的 cDNA 时，这种较低的 RNase H活性很有利。反映开始时，引物与RNA模板形成的杂交体正是RNaseH的底物，故cDNA合成一开始就存在 mRNA 模板降解和 DNA 合成起始之间的互相竞争。此外，假

31、如反转录酶在合成过程中暂停作用，RNaseH 就会在 DNA 链 3末端附近切割 mRNA 模板，因此禽酶的高 RNase H 的活性会影响 cDNA 的产量和长度。 (2)在反映温度上，AMV 反转录酶为 42，M-MLV 则是 37。鼠酶在 42下会迅速失活，因此对复制富含二级结构的 RNA 来说，使用禽酶的效率高于鼠酶。但要注意，禽酶制品中常具有切割 DNA 的内源核酸酶活性。 (3)反映的最适 pH：AMV 反转录酶为 8.3，M-MLV 反转录酶为 7.6。两种酶对 pH 都非常敏感，即使误差为 0.2，反映产物也会大大缩短。由于 Tris 缓冲液的 pH 值随温度而变化，因此在实验

32、中必须校正 pH 值。 (4)DNA 内切核酸酶的活性：在 Mn2+存在时，AMV 反转录酶可以切割单链 DNA，这种活性无专一性位点，对热稳定。而 M-MLV 反转录酶没有此活性。 9 答：一方面，它们是非常高效的酶，可获得长度为几千个碱基的转录物；第二是转录速度快，2g 模板 DNA,在 30 分钟之内可以合成出 60g 的转录物；第三是起始转录的启动子序列非常特异，这对于进行链特异的放射性 RNA 探针的标记非常有利；第四，目前纯化的 T3 和 T7RNA 聚合酶是从过量表达的细胞中分离的，价格便宜，比活性高。10答：多核苷酸激酶可以把 ATP 的-P 转移到 ssDNA、dsDNA、s

33、sRNA 或 dsRNA 分子的 5-OH 端上。反映的方式有两种：(1)向前反映(forward reaction) 若 DNA 的 5端是羟基，激酶直接将 ATP 的-P 转移到 DNA 的 5-OH 末端。(2)互换反映(exchange reaction) 假如 DNA 的 5端是 P 的话，则该反映需分两步走，一方面在过量的 ADP 存在下，T4 多核苷酸激酶将磷酸化的 DNA5末端磷酸转移到 ADP 上，然后再从-32pATP上将标记的P 转移到 DNA 链上，使其重新磷酸化。11答：重要差别是：CIP68时失活，而 BAP68稳定，且耐酚抽提。应用：(1)dsDNA 的 5，端脱

34、磷酸，防止 DNA 的自身连接。但是用 CIP 解决后，最佳将 CIP除去后，再进行连接反映。(2)DNA 和 RNA 脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。12答： 外切核酸酶是从丸噬菌体感染的 Ecoli 中分离纯化的，可以从双链 DNA 上依次切下 5单核苷酸，作用底物是双链 DNA 的 5磷酸末端，不能切割羟基化 5端。该酶虽然能切割单链 DNA,但效率较低(下降 200 倍)。不能切割带切口或缺口的 dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中重要用于除去双链 DNA 突出的5末端，以便让末端转移酶加尾。13答：DNaseI 是一种内切核酸酶，在 Mg2+存在下

35、，DNaseI 随机切割 DNA 两条链中的任意一条链；当 Mn2+代替 Mg2+时，DNaseI 几乎是在双链 DNA 两条链相对的位置上打开缺口，使双链 DNA 断裂，产生的末端几乎是平末端或只突出 12 个核苷酸的 DNA 片段。DNaseI 有许多用途：(1)在切口移位标记中，制造切口；(2)在足迹法中保护 DNA；(3)除去 RNA 制备物中的 DNA；(4)体外转录中除去 DNA 模板；(5)检测染色体中的转录活性区；(6)产生可在噬菌体 M13 载体上进行测序的随机克隆。第四章 质粒的分子生物学与质粒载体四、简答题 1YAC 载体具有什么样的功能性 DNA序列?为什么在克隆大片段

36、时，YAC 具有优性？ 2列举质粒载体必须具有的 4 个基本特性。 3什么叫穿梭载体? 4说明减少质粒和噬菌体载体上某种酶的辨认位点的方法和原理。 5虽然质粒的带动转移给质粒载体的安全性带来一定的困难，但是通过带动转移将质 粒转移到特定的受体菌中也是基因工程中常用的实验技术。请举一例说明之。 6为什么来自 HfrF的重组体几乎总是 F? 7解释为什么不同的 Hfr 菌株具有不同的转移起点和方向? 8如何从一个 Ecoli 的 Hfr 菌株中分离到一个 Fgal的菌株? 9你已经分离了一个新的 F因子， 如何用最简便的方法知道最初的 F 因子的部分 DNA已经被切除，并被一个外源 DNA(也就是

37、细菌 DNA)所替代? 10你能用哪一种基因转移的方法拟定 (1)Ecoli 染色体上一个新发现的基因座在其染色体上的位置；(2)一个新分离的突变在基因内的位置。 11用加有注释的图表说明 F 质粒是如何从一个 F+细胞转移到 F-细胞。并简要说明转 移复制如何不同于营养体的复制。 五、问答题1. 什么是复制子(replicon)? 2. 什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么? 3. 什么是质粒的带动转移? 4. 说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理。5. ColEl 衍生质粒拷贝数调节的机理是什么? 6. R1 质粒拷贝数受到如何的调节控制? 7. 质粒如何

38、维持在细胞中的稳定? 8. 引起质粒不相容性的重要因素是什么? 9. 由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件涉及哪几个方面? 10请指出质粒 pSCl01 的一些生物学特性(涉及结构和遗传)及在基因工程中的作用。11自然界中具有抱负条件的质粒载体为数不多，即使是 ColEl 和 pSCl01 这两个自然质粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造涉及哪些基本内容? 12质粒改造的发展过程如何? 13在质粒中如何增减酶切点? 14有人用限制性内切核酸酶 EcoRl 分别切割松弛型质粒 ColEl

39、和严紧型质粒 pSCl01(各有一个切点)，然后重组连接形成一个杂种质粒 pSCl34，请推测这种质粒有什么特性和用途。16 YAC 克隆载体常出现哪些问题?四、简答题 1答： YAC带有天然染色体所有的功能元件，涉及一个着丝粒，一个DNA复制起点，两 个端粒。YAC可以容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大 片段的插入更有也许包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离， 同时可以减少完整基因组文库所需的克隆数目。 2答： (1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。 3答：具有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，

40、有两个复制起点和既能在 细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿 主(来回穿梭)乙 4答： 质粒： 体外诱变或体内诱变(通过具有限制性作用的宿主)。 噬菌体：体外诱变。 5答： 例如，在植物基因工程中，质粒对农杆菌的转化比较困难，往往采用三亲交配 (triparental matings)的方法将质粒转移到农杆菌细胞中。三亲交配就是运用质粒的 带动转移。 6答： 转移复制是从整合到细菌染色体的F因子内的一个位点开始，因此只有部分F因子位于被转移染色体的前导端；余下的F因子只在整个细菌染色体都被转移的特殊情况下才发生转移。 7答： 不同Hfr株的F因子整合到细菌染

41、色体中的位点及方向不同;F因子的位置和方向决定了转移起点和方向。 8答： 用一个F因子整合在最后被转移的gal+基因附近的Hfr株，F-gal- 与Hfrgal+杂交，30分钟后中断，筛选含gal+的接合体。在这种情况下，只有含gal+的接合体才是接受了Fgal+质粒的菌株，稀有的含Fgal+质粒的菌株是在Hfr群体中自发产生的。 9答： 分离F和F质粒并缓慢加热DNA使解离为单链，将变性的DNA混合，缓慢冷却，使 DNA之间退火。有的双链分子是由F因子和F因子的DNA单链组成的杂交双链，电 镜下可以看见非同源区为单链环(图1)图1 F和P质粒DNA杂交鉴定非同源区 10答： (1)Hfr转化

42、和中断接合； (2)转导。 11答： 转移复制起始于oriT（转移复制起点），以滚环模式进行复制。营养复制从oriV开始(营 养复制起点)，以复制方式进行双向复制(就像大肠杆菌自身染色体的复制同样)。 转移过程示于图A2。 说明： 1）在Hfr转移的滚环复制中，复制仍然从oriT开始。但转移链并不形成双链，转移到F-细胞中的各种不同单链片段会重组到细菌染色体上。 2）由于转移起始于F质粒内，因此只有F质粒的一部分会转移到F-细胞中。受体接合后仍然是F-。 3）以这种模式转移，细菌染色体就像是F质粒的一部分(而不是F质粒表现为细菌染色体的一部分)。 图2 细菌的接合及F因子转移 五、问答题 1

43、答： 复制子是可以进行独立复制的一种遗传因子。每一个复制子都具有一个与特定的RNA聚合酶结合的序列和DNA复制起始部位，即开始复制的复制区。此外，复制子也涉及一个复制的终止区。一个染色体可以是一个复制子(例如细菌的染色体)，也可以具有多个复制子(如真核生物的染色体)。一个失去了复制起点的DNA不能独立进行复制，但是，当它和另一个复制子连接起来时，就能在后者的带动下进行复制。 2 答： 质粒的相容性(compatibility)是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，假如可以共 存则叫相容(又叫亲和)，不能共存则称为不相容。从本质上说，可以共存于同一个 细胞中的质粒具有不同的复制机制，因而复制时互

44、不于涉，并保持稳定。根据质粒 的这一特性将质粒分为若干个不相容群(incompatibility group)。同一个不相容群中 的质粒不能共存于同一个细胞，由于它们的复制机制相同，因此凡能共存于同一个 细胞中的质粒属于不同的不相容群，由于它们的复制机制不同。 3答： 质粒带动转移的转移作用(mobilization)是指由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程。带动转移型质粒由于缺少10个以上合成纤毛所需的基因，因此，它们要转移的话，必须使用同一个细胞中由自主转移型质粒形成的纤毛。带动转移型质粒必须具有自主转移型质粒的oriT位点，由于自主转移性质粒的tra基因产物可以作用于任何质粒的

45、oriT位点，可带动转移的质粒也具有一些基因，称为mob基因，这些基因负责DNA的转移，并有一个oriT序列。这些基因位于称为mob的区域，并且与自主转移型质粒的tra基因相类似。产肠杆菌素质粒ColEl、ColE2等就是非接合型质粒的例子。ColEl的分子小(6.6kb)局限性以编码所有转移体系所需的基因，因而不可以自身转移，但它具有两个参与带动转移的基因：一个是bom，另一个是mob。 4答： 变性定位法(denaturation mapping)是根据环状双链DNA基因组中某些特异性区段比该分子上其他区段对热、碱、酶等变性因子有较高的敏感性，而采用热、碱、酶等变性因子使环状DNA进行变性

46、，结合电子显微镜技术，比较不同复制时间的复制区同变性部位的距离变化，以拟定环状双链DNA复制起点和方向的方法。用此法拟定噬菌体的复制是一个起点、双方向对称复制。 限制性内切核酸酶定位法(restriction endonuclease mapping)是用限制性内切核酸酶切割质粒DNA，结合电子显微镜技术，比较不同复制时间的复制叉同两端距离的变化，以拟定复制的起点和方向。用这种方法拟定了ColEl质粒复制是从离EcoRI切点的17的特异位点开始的，并从起点开始单向复制。 5答： 这类质粒的复制重要是通过一种由质粒编码的小分子的RNA，称为RNA I的分子来调节。这种小分子的RNA重要是通过干扰

47、另一种称为RNA的加工来克制DNA的复制。质粒DNA复制的引物是由RNA提供，在复制起始区，RNA同DNA形成一种RNA-DNA杂种分子，RNA被RNA内切核酸酶RNase H切除，在3端形成一个羟基作为DNA聚合酶I催化的复制起始引物。RNA必需被对的地加工，否则不能作为复制起始的引物。RNA I和RNA是互补的，它们是由DNA双链的同一区域互补链合成的。正由于互补，这两种RNA就可以配对形成双链的RNA螺旋，这种双链的RNA干扰了RNA的加工，干扰了复制。 用这种机制可以解释ColEl质粒是如何维持它的拷贝数的。由于RNA I是由质粒DNA合成的，当质粒的浓度增高时，同时合成了较多的RNA

48、 I。高浓度的RNA I干扰了大多数RNA的加工，复制受到克制。当质粒的拷贝数达成每细胞16个时，这种复制的克制作用几乎是完全的。除了RNA I外，质粒编码的一种蛋白质，叫作Rop蛋白，协助维持拷贝数。这种蛋白形成一个二聚体，可以增强RNA I和RNA的配对。所以在RNA I的浓度相对低时引物的加工也受到克制。ColEl质粒的复制的调节模式得到实验证明，这也是最早发现的反义RNA的调节作用。 6答： Rl质粒的repA基因编码一种蛋白质叫做RepA蛋白，这种蛋白是Rl质粒复制起始所必需的。repA基因可以从两个启动子转录。一个启动子叫做PcopB可以转录repA和copB基因，得到一种mRNA

49、，可以翻译成RepA和CopB两种蛋白质。第二个启动子PrepA在copB基因内，因此只能转录一种仅合成RepA蛋白的RNA。由于PrepA启动子受到CopB蛋白的克制，它只能在质粒进入细胞的开始阶段，在CopB蛋白合成之前打开。质粒进入细胞后从PrepA开始RepA蛋白的短暂合成引发了质粒DNA的复制起始直到达成它的拷贝数。然后，PrepA启动子被CopB蛋白克制，repA基因只能从PcopB启动子开始转录。 一旦质粒达成拷贝数，RepA的合成以及它参与的质粒复制受到一种叫做CopA的RNA的调节。copA基因是用它自身的启动子转录的，这种RNA产物影响着从PcopB 启动子转录的mRNA的

50、稳定性。由于copA RNA是从repA编码基因翻译起始区的相同区段的另一条链转录而来的，所以这两个mRNA是互补的，并且可以配对形成双链RNA分子。核糖核酸酶(RNase)，是染色体基因编码的，只能切割双链RNA，将切割copA-repA mRNA结构。切割作用反过来会引起RepA的降解，不再合成RepA蛋白。 7答： 质粒通过以下几种机制维持在细胞中的稳定： (1)多聚体质粒的分解 (2)分离(partitioning) (3)质粒溺爱(plasmid addiction) 8.答： 质粒不相容性重要是由两方面的因素引起的：(1)由于复制控制而产生的不相容性。 复制控制系统不能将它们作为两

51、个质粒来辨认，因而只能随机选择进行复制；(2) 由于分离引起的不相容性。假如两个质粒具有相同的par功能，这两个质粒有也许 是不亲和的。当共存的质粒具有相同的par功能时，在细胞分裂时只有一种可以被 分派到子细胞。然而，有时一个子细胞只能得到一种类型的质粒，而另_个细胞得 到此外一种类型的质粒，这样得到的子细胞都是丢失了一种质粒的细胞。 9.答： (1)非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说，都不希望载体可以进 行自主传递，也不希望被带动转移。 (2)具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307(ColEl的衍生质粒)在哺乳动物正 常体温下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于

52、限定的宿主细胞中。(3)一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，由于重组后有也许给宿主带来突 变。 (4)有较小的宿主范围。 10答： 质粒pSClOl是严紧型控制的低拷贝的质粒载体，大小为9.4kb，相称于分子量 58106 Da。每个细胞大约46个拷贝，不能用氯霉素进行扩增。在质粒pSCl01 上有一个四环素抗性基因和限制性内切核酸酶EcoR I、Hind、BamH I、Sal I、 Xho I、Pvu以及Sma I的单切点，其中Hind、BamH I、Sal I等三个切点在四 环素基因内，在它们的位点插入外源片段会导致四环素基因的插入失活。 质粒pSCl01是第一个用于基因工程的质粒载体。

53、由于该质粒是严紧型复制，所以 最适合那些不宜超量表达的基因克隆。 11答： 基本内容涉及： (1)删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段，削减载体的分子量，使载体 具有更大的容纳外源片段的能力。 (2)加上易于选择或检测的标记。 (3)限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位 置。 (4)加上一些调控元件，有助于克隆基因的表达。 (5)安全性改造，限定载体的宿主范围。 12答： 大体经历的过程分为三个阶段： (1)改造质粒的复制挣I生和可选择性 初期对贾匣载体的改造重要是将选择标记引入含pMBl(或ColEl)复制子的质粒中。 (2)调整载体的结构，提高载体的效

54、率 一方面将载体的长度减至最小，而另一方面则同时扩充载体容纳外源DNA片 段的能力，以便于接受用各种各样的限制酶切割后产生的片段。 质粒载体越小越受欢迎，因素是：一方面转化效率与质粒的大小成反比，而当质 粒大于15kb时，转化效率将成为限制因素。因此，质粒越小，可以容纳的外 源DNA的区段就越长。另一方面，质粒越大，就越难于用限制酶切割来进行鉴定， 由于分子量大，酶切位点就多。再者，由于质粒越大，复制的拷贝数就越低， 因而，外源DNA的产量有所减少。 (3)质粒中引人多种用途的辅助序列 引入的序列涉及：可通过组织化学检测方法肉眼鉴定重组克隆的选择标记、产 生用于序列分析的单链DNA功能元件、体

55、外转录外源DNA序列、重组克隆 的正选择和外源蛋白质的大量表达的序列等。 13答： (1)削减酶切点 可以用完全酶切或部分酶切。例如，EcoR I在某种质粒载体上有两个切点，一个在抗性基因内，另一个在其他部位。现在要除到非抗性位点上的切点，可用该酶部分酶解这种质粒，用S1核酸酶削平末端后自连，转化后用原抗性筛选即可。假如EcoR I的两个切点都不在抗性基因内，切割后产生的两个片断中有一个是质粒非必需的，则可用完全酶切，自连后筛选，就可筛选到失去一个切点的质粒。 (2)增长酶切点 增长切点有两种方法：一是运用人工合成的接头，或是运用天然的接头。所谓接头(1inker,adapter)是指具有限制

56、性内切核酸酶辨认和切割序列的DNA片段一人工接头重要是用化学方法合成的具有限制性内切核酸酶作用序列的DNA片段。 发明限制性内切核酸酶切点的第二种方法是运用现有的具有多种限制酶切点的DNA片段作为接头。如pSCl01质粒上具有多个限制酶的切点,(EcoR I、Hind、BamH I和Sal I)，并且这些酶切位点靠得非常近，它们位于一段长约800核苷酸之内的DNA片段上。假如用EcoR I和Sal I将这种片段切下来，就可以得到具有EcoR I、Hind、BamH I及Sal I 4个切点的片段。根据载体的情况，可将该接头插入到质粒上，便可增长切点。 14答： 由于ColEl不能在缺失DNA聚

57、合酶I的细菌中复制，所以在这种细胞中就使用pSCl01的复制起点。而质粒pSCl01不能在不合成蛋白质的细胞中复制，在这种情况下则使用ColEl的复制起点。一般情况下优先使用ColEl的复制起点。这种质粒由于具有两个复制起点，可以根据需要，选用不同的宿主菌，表达特定的外源基因。 16答： (1)YAC有嵌合现象，一个YAC中克隆的DNA片段也许来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的550。由特定的染色体构建的文库，嵌合体占克隆总数的515。 (2)YAC内部有重组现象，插入的DNA较大，序列发生重排，导致和本来染色体的序不一致，重组很难检出。 (3)YAC尚有缺失现象，

58、影响YAC文库的代表性。 (4)YAC结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC和酵母天然染色体分开。 (5)构建好的YAC转化原生质化的酵母菌，转化效率低。 (6)建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大。第五章 噬菌体载体四、简答题1在转导过程中，通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养基上，为什么? 答：这些平板起对照作用。第一个对照实验可检测和估计自发突变为野生型的频率；第二个对照实验确证噬菌体悬液中无菌情况(即不能有任何活的供体细菌)。2 如何将野生型的九噬菌体改导致为一个抱负的载体? 答：(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶

59、切位点； (3)添加选择标记；(4)引入终止突变3用 Sal I 切割从噬菌体 J2 分离的 DNA 时，得到 8 个片段，分别是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1 和 11.4kb。但是，用 SaI I 切割从被感染的寄主细胞中分离到的 J2 噬菌体DNA 时，只得到 7 个片段，分别是:1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9 和 11.4kb，根据这些结果，您得到哪些信息? 4在 c基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑? 5噬菌体 DNA 被包装到噬菌体的头部，需要哪些基本条件?为什么? 答：(1)两个 COS 位点；(2)线性 DNA

60、；(3)大小在丸噬菌体基因组的 75一 105的范围之内。 五、问答题 1为什么野生型的噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体? 答：(1)噬菌体 DNA 没有容载能力，由于噬菌体的头部对 DNA 包装的量是有限制的，不能大于基因组的 105，所以要将噬菌体改导致载体，必须削减分子量。 (2)野生型的DNA 对于一些常用的酶都有多个辨认和切割位点，不便于克隆。(3)没有可供选择的标记。 (4)野生型的噬菌体具有感染性，因此不够安全。 2什么是蓝白斑筛选法? 这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。重要是在载体的非必要区插入一 个带有大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片段，携带有 lac 基因片段的载体转入 lac的宿主菌后，在具有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插入 lac(或 lac 基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal 的能力，转人 lac的宿主菌后，在具有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。 3蓝白斑筛选