微藻分离及保存

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1、1 用液体培养基分离培养的方法 用液体培养基培养分离的藻种首先要配制培养液,液体培养基通常用 消毒海水按常规配方(例如 F/2 培养基)配制,或者根据不同的微藻采 用其专用的培养基配方。分离和培养的工具、器皿要进行高温灭菌1.1 样品系列稀释分离法1.1.1 原理 在无菌操作的条件下,对分离的样品采用逐步稀释的方法,边稀释,边 在显微镜下镜检,直到视野中每滴样品只含1 个细胞时,即停止稀释, 开始分接培养。1.1.2 方法 首先在第一个试管中加入要分离的藻液样品,其他试管中加入等量培 养液,加入培养液的体积根据分离样品的具体情况而定(如10ml),从 第一试管中吸取和培养液同体积的藻液样品(1

2、0mL)加到第二支试管 中,充分振荡摇匀,此时藻液被稀释了 2 倍,再用一支新的消毒的移液 管，吸取第二支试管中的稀释藻液(10mL)加入第三支试管中,如前振 荡,使均匀稀释,此时藻液被稀释了4倍,以后的试管依次采用同样的 方法稀释,直到镜检每滴稀释样品中只有1个细胞,可以用这样的稀 释藻液进行培养,最终的稀释液种分装到不同的试管中,用棉塞塞好 试管,把试管放在有漫射阳光的地方,每日轻轻摇动几次,发现试管中 有藻色后进行镜检,如镜检到单种则表示分离成功,此时已达到了分 离、纯化的目的,可进行扩大培养。1.1.3 应用概况样品系列稀释分离法设备简单,操作简便,工作量小,但是这个技 术有很大的盲目

3、性,分离的样品很可能来自两个或更多的细胞,分离 的微藻单种不一定是目标种,但可能分离到其他种或新种,尤其对于 从天然水域采取水样的初步分离非常适合,而且对于微藻的种类、大 小没有限制。1.2 微吸管分离法1.2.1 原理在无菌操作条件下,用极细的微吸管,在显微镜下把目标藻样从 一个玻片移到另一个玻片,采用同样的方法反复操作,直到镜检水滴 中只有目标单种为止。1.2.2 方法在微吸管的顶端套一条长约Bern的医用乳胶管，分离操作时，用 手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上,在显 微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞，放松手指，藻细胞被吸入微 吸管;接着把吸出的水滴放在另一载玻片上

4、，显微镜检查水滴中是否 只吸到藻细胞，经过如此再反复操作，直至达到单种分离的目的。然后 把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内，放在适宜的光照下 培养，试管有藻色后镜检，培养为单种的试管，其他不合格的弃掉。1.2.3 应用微吸管分离法的特点是易找到特定的种类，所用的设备也较简单， 但操作技术难度较大，往往吸取一个单细胞需要几次至十几次才能成 功，而且适于分离个体较大或丝状的藻类，如螺旋藻、骨条藻等，较小 的藻类用此方法比较困难。1.3 水滴分离法1.3.1 原理在无菌操作的条件下,把要分离的藻样用微吸管在玻片上滴成大 小合适的小水滴,镜检水滴中只有一个要分离的单种,即可冲入试管 培养。1.

5、3.2 方法用小烧杯装稀释的藻样,将微吸管插入藻样中,提取微吸管,让多 余的藻液滴出,然后把管口与消毒过的载玻片接触,即有一个小水滴 留在载玻片上。一个载玻片滴34 滴,间隔一定距离,然后在显微镜下 观察。若一个水滴中只有一个需要分离的藻细胞（无其他生物混杂）, 即用移液管吸取培养液把该水滴冲入试管中,试管口塞上棉塞,放在 适宜的条件下培养。该分离法的关键是藻样稀释要适宜（稀释至每个 水滴约有12 藻细胞）,水滴大小适宜,以在低倍镜下能看到水滴全部 或大部分为宜,并且观察要准确、迅速。1.3.3 应用水滴分离法操作简便易行,但具体操作中要注意上面提到的问 题。此方法对于藻细胞的大小没有限制,尤

6、其适于分离已在培养液中 占优势的种类。2 固体培养基分离方法（平板分离法）作为微藻分离用的固体培养基,是在常规的液体培养基中加入一 定量的琼脂,并且使其溶解和高温高压灭菌后,通过适当的方法,把要 分离的藻样接种在培养基上,通过一定的时间培养,在培养基上长出 单个的藻落而达到分离的目的。2.1 固体培养基制备和灭菌在常规的液体培养基中加入一定量的琼脂(1.0%2.0%),加热溶 解后,分装到三角烧瓶中,置于高压蒸汽灭菌锅器中灭菌,温度121,时 间2030min,待培养基冷却到50C时,无菌操作倒入到灭菌的培养皿 中待用。2.2 接种的方法接种在超净工作台上进行,接种的方法有两种。2.2.1 喷

7、雾法首先用消毒海水把要分离的藻样进行适当的稀释,装入消毒过的 医用喉头喷雾器中,打开培养皿盖,把藻样喷射到培养基平面上,使藻 样在培养基表面上形成分散均匀的一层薄水珠。水样稀释到合适的程 度是指水样喷射在培养基平面上必须相隔1cm以上有一个藻细胞，否 则将来长出的藻落距离太近,不易分离。2.2.2 划线法把接种环在酒精灯上灭菌后,蘸取藻样轻轻在培养基平面上做第 一次划线34条,把培养皿转动约70 角,并把接种环在酒精灯上灭菌, 通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三、第四次划线。 由于第一次划线接种环上的藻细胞比较多,在第一划区藻细胞可能密 集不能分离开,但通过后面的划线可能分离出单

8、独的藻类群落。2.3 培养培养基上接种后,放在适宜的光照下培养,经过一段时间的培养, 在培养基上长出藻类群落,通过显微镜检查后,用纤细的解剖针把单 个的目标藻落连同一小块培养基取出,移入装有培养液的试管中培养, 待试管中有藻色后镜检,如无其他生物混杂,达到了单种分离的目的。2.4 固体培养基分离法的应用 用琼脂做的固体培养基的分离方法并不适合所有的微藻,大多数的绿 藻都可以在这种培养基上生长,从而达到单种分离的目的,但有的微 藻在琼脂培养基上生长较差,甚至不能生长,如有些金藻类和硅藻类, 这可能是琼脂培养基的表面张力较大的缘故,可以在培养基中加入 100500g/L 的表面活性剂可以促进生长。

9、一般的培养基中营养盐所 用的氮盐为硝态氮,以尿素代替硝酸钠,球等鞭藻 3010、3011、湛江 叉鞭藻、牟氏角毛藻在琼脂培养基上可以正常生长,这几种单细胞藻 具有尿素酶,能分解尿素作氮源,而利用硝酸钠作氮源,需要将硝态氮 还原成铵态氮，这几种藻含有的异养菌较少，又由于处于无菌的环境 中,所以藻种在氨态氮中能正常生长,而在硝态氮中不能正常生长。固 体培养基中琼脂的加入量，要根据琼脂的质量灵活使用，培养基太硬， 影响营养盐的缓释,水分易失去,不利藻落的生长,培养基太软不利于 划线,容易划破培养基,影响操作。固体培养基分离法工作较繁琐,工 作量大,但分离单种成功的几率较高。三、藻种保存1 保存方法1

10、.1 继代保存继代保存是指把藻种接种在单一固体、液体或固-液双相培养基上,在低温（是指温度控制在58C之间）、弱光（通常指在冰箱内装1 支8W的日光灯照明）条件下培养,一代一代传下去以延续“种族”的 1 种方法,接种 1 次可保藏半年到 1 年。1.1.1 培养基的制备 液体培养基通常用消毒海水按常规配方（例 如 F/2 培养基）配制；固体培养基即平板培养基,作为保藏藻种用的固 体培养基,其营养物质的浓度应按常规配方增加 1 倍,用合适的仪器 分装后,加入适量琼脂,培养液经高压蒸汽灭菌后,取出,试管应倾置 成斜面,三角烧瓶则平放,冷却后即成固体培养基。1.1.2接种 要保藏的藻种,可接种在固体

11、或液体培养基上,也可以 在固体培养基上加入比其体积多两倍的培养液,然后在液相接种少量 藻液,称双相培养。1.1.3培养和保藏 液体或双相培养基保藏的藻种,接种后可直接 放置低温、弱光的条件下保藏，也可在适宜光照条件下培养34d后 再移置低温、弱光条件下保藏。而仅用固体培养基保藏的藻种,接种 后应首先放在适宜的光照条件下培养,待藻细胞生长繁殖达到较高密 度,在平板上可见明显的条状或块状的藻细胞群,再移置低温、弱光的 条件下保藏。1.1.4研究及应用概况 液体培养基简便易行,但保存期短；固体 培养基保存期较长但容易干涸,而双相培养既可避免干涸问题,又能 保存更长时间,保存效果比单一培养基好。而且,

12、还可通过液相中有无 游动胞准确地检查藻的生存与否。由于简便易行,目前在生产和科研 实践中,保存藻种最常用的仍是液体培养基。作为目前一般实验室保 存藻种的常规方法,继代保存简便易行,设备简单,但工作比较琐碎, 耗费时间和精力。在多次的移接过程中,稍有疏忽就会使藻种污染上 杂藻、细菌或原生动物,使保种失败,而且还会使藻种逐渐老化。为避 免这种情况,每 1 种藻类的保存,至少要保存 3 种不同年龄的藻种,最 早的藻种用于传代,其余 2 种以备培养发生意外时急用。1.2 固定化保种固定化细胞(immob il izedcells)是指将游离细胞包埋在多糖或多聚 化合物制成的网状支持物中,进行无菌培养。

13、1.2.1固定化保种原理 固定化细胞培养是最接近自然状态的培养 方法之一,细胞处于静止或相对静止状态,而培养液为流动态。由于微 藻细胞受到固定载体的束缚,影响细胞代谢过程,从而抑制细胞的生 长和分裂。固定化后的各种微藻在固定化载体内进行细胞分裂并形成 大小不一的藻落。当藻落达到一定密度后,细胞的生长就逐渐停止。 有些种类固定化细胞会逐渐死亡解体,而另一些种类,若定期更换培 养液和保持合适的培养条件,细胞仍可保持旺盛活力不会死亡。因此, 不同的微藻固定化保存的时间长短不同。1.2.2 固定化方法 在固定化培养中,固定细胞的固定剂主要是一 些多糖和多聚化合物,如褐藻酸盐、琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖、

14、明 胶、聚丙烯酰胺等。现以褐藻酸盐为例来说明固定化保种的方法。将 经过消毒的褐藻酸钠(2.5%,w/v)与藻液(浓度约lX105cell/mL)按 4:1的比例充分混匀，用9号针头的注射器以6mL/min的速率滴入2% 的 CaCl2 溶液中,边滴边摇动。约 30min 后形成固化的褐藻酸钙胶珠, 从而使藻细胞得以固定。将形成的褐藻酸钙胶珠用消毒海水洗涤两次, 置于 100mL 的三角烧瓶内保存培养。1.2.3 研究及应用概况从 1978年以来,固定化技术就被用来作为延长光合细胞寿命的一种重要手段。现在,对微藻的一些试验表明, 固定化技术可作为微藻种质保存的重要方法之一。由于各种藻的特性 不同

15、，固定化保存的时间长短也不尽相同。Tamponnet等报道了固定 化纤细裸藻存活2年；Hertzberg等报道了固定化的三角褐指藻(Phaeodactylumtricormutum)保存 18 个月，中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)保存6个月，但矮小海链藻 (Thalassiosirapseudonana)和贺氏钙板金藻(Emilianahuxliyi)仅 能保存3个月，而蓝螺藻(Scrippsiellatrochoidea)固定化培养1个 月后就会死亡；马志珍等通过固定化方法保存三角褐指藻 (Phaeodactylumtricormutum)的存活时间可达2年左右。 固定

16、化保种的设备较为简单，培养保存时间较长，活化复苏快，一般经 34d的延缓期，最多56d就能复苏生长，但固定化程序较复杂，需 要细心操作。另外，大多数微藻在培养后期常会从胶珠中溢出，有的胶 珠还会融解，这是今后工作的重点和难点之一。而且，现有的资料表明， 某种固定化方法只适用一定种类的微藻，对同一种固定化方法，不同 种类的微藻会有不同的反应，其原因是复杂的，探讨其内在机制还需 要做更深入、广泛的研究。也只有进行更广泛的试验后，才能确定是 否能用固定化技术来作某种微藻的种质保存，这就给固定化保种技术的推广带来了一定的困难。1.3 超低温保种技术所谓超低温即指液氮低温（T96C）,以区别于其他低温概

17、念的冰 箱温度（4-40C）和干冰温度（-79C）。微藻的超低温保存研究起步 较晚,目前普遍采用2步冷冻法,即慢速降温进行冷适应,然后投入液 氮中保存。并且,一般进行快速解冻活化复苏效果较好。但由于微藻 的种类很多,适宜的保存条件各异,如何因种而异,找出不同微藻的超 低温保种方法,应是今后努力研究的目标。1.3.1超低温保存的基本原理在液氮低温T96C下,生物体的物质代谢和生长活动几乎完全停止,可是它们仍处于可逆的成活状态。通过添加一定的抗冻保护剂,防止细胞在降温冰冻过程中严重脱水和 低温休克,避免细胞内冰晶的形成,采用适当的冰冻速度,使细胞安全 地越过冰晶形成危险区（从细胞介质或原生质的冰点

18、到-60C）,进入 玻璃化状态,以达到长期保存的目的。所谓玻璃化是指液体转变为非 晶态（玻璃态）的固化过程。玻璃态固体分子之间的关系和液态无明显 变化,水分子停止运动,保持原来的无序状态,形成坚硬、均匀的团块 结构。玻璃化的细胞不会出现原生质的严重脱水,细胞结构完整,解冻 后即可恢复生长繁殖能力。1.3.2超低温保存的基本方法I降温液氮法2() :C. J5dII玻璃化低温保存 玻璃化是近年来细胞保存的1种新的方法,比 冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是1种较理想的低温保存途 径。玻璃化有2条途径:一是极大地提高冷却速率;另一条是增加溶液 浓度。常用的有沉浸法、喷溅法和镜面接触法。沉浸法是

19、将生物样品 快速地浸入（或弹入）低温液体中。喷溅法是将低温液体经过喷嘴高速 喷溅到生物样品上,或是将生物样品的悬浮液高速喷溅进入低温液体 中，以达到样品被快速冷却的目的。镜面接触法是将生物样品快速地 与某固体镜面接触,而此固体镜面预先被冷却至77K或更低温度。为 了达到高的冷却速率，要求固体镜面具有高的导热系数和比热，常用 的有铜、银、蓝宝石等。1.4 浓缩低温保存技术 浓缩低温保存法是将藻液高密度培养后,采用物理、化学的方法浓缩 1000 倍左右，再低温保存。国外自80 年代末开始就有对海洋经济微 藻的浓缩方法和低温保存方法进行研究,取得了不少的研究成果，其 中美国、英国和日本已有相应的产品

20、 （微藻浓缩细胞或称“藻膏” ） 问世。蒋霞敏等将小球藻和球等鞭金藻 3011（IsochrysisgalbanaPark） 浓缩后，在5C7C的冰箱中保存13个月后恢复生长获得好于常 温 的 效 果 。 孙 建 华 、 王 如 才 （ 1993 ） 对 小 新 月 菱 形 藻 （Nitzschiaclosterium）、球等鞭金藻的浓缩和保存方法进行了研究， 浓缩藻液在1C4C的低温下加保护剂SAMs保存3个月，复苏后效 果良好。浓缩低温保存多用于海洋微藻。微藻浓缩液的生产，可以使 海洋微藻的生产与使用保留一定的时间差。但相对保存时间较短，海 洋微藻的抗逆原理还有待作更多的研究和探讨。1.5

21、 冷冻真空干燥保存法冷冻真空干燥保存法是在极低温度下（-70C左右）快速冷冻，然后 在极低温度下真空干燥，使藻种的新陈代谢活动处于高度静止状态。 19世纪末Fkral与Mudd创立的冷冻真空干燥法是迄今公认最佳的藻 种保存法，严珍等选择脱脂牛奶作为保护剂，将藻液放入安瓿管中， 冷冻、干燥并抽真空，火焰熔封。在低温避光处保存，预计最大保存 年限为 18 年。冷冻干燥保存法优点是微藻复苏效果好，保藏期内可 避免其他杂菌污染，便于携带运输，易实现商品化生产；其缺点是操 作繁琐、对设备要求高等；应用前景十分光明。1.6 低温甘油生理盐水法低温甘油生理盐水法是对甘油原液保存法的改进。加入生理盐水适当 降

22、低了甘油的高渗作用，更有利于藻种的保存。在藻液中入一定的甘 油作保护剂，同时加入一定的生理盐水，混匀后直接放置在-20C 土 0.5C冰箱放置保存。保存时间长，一般3年左右。1.7 其他 平板保藏及斜面保藏法、液体培养基保藏法、固液双相继代保藏法和 甘油管保藏法，保藏方式如图 2-1。平板保藏、斜面保藏和液体培养基保藏时，应该放在弱光处，平均每 隔 23 月转接一次。固液双相保藏的具体步骤:先将固体培养基灭菌，将灭菌的培养基放 置在50 0C的烘箱中冷却，向冷却后未凝固的培养基中注入适量藻液 混匀，待培养基凝固后加入灭菌的液体培养基液封，将培养基放置在 弱光、阴凉处保藏，此种保藏方式能保藏1

23、年以上。甘油管保藏时，甘油的体积比为10 %-25 %，保藏在-20 0C 的冰箱中， 甘油管一般能保藏1年左右。图24曲猱的几押保議方式Fig.2 J Several nservatiiDB methods of mkroalgae注阴：A为平板划議侏藏，B. E为固泯咫相帰超，C为甘斶管侏藏，D力斜面繰載 F为液体 吗养也弱戎傑羅.从理论上讲，以上方法均可用于微藻的保存,但由于所需试验系统比 较复杂，设备比较昂贵，玻璃化冻存微藻尚处于起步阶段，但它无疑是 对微藻超低温保存的1种新的尝试。2影响因素微藻的超低温保存除与微藻的种类、年龄和生理状况有关外，下 面的因素至关重要。2.1降温速率在超

24、低温保存中，降温速率对微藻的存活有很大影响。只有降温速度适中，细胞才能适度脱水，不致形成胞内冰,又不致 脱水过度产生容积效应，从而大大提高细胞存活率。下图几种细胞的 低温保存存活率与冷却速率的关系，说明对应不同的细胞，有不同的 最佳冷却速率。在实践中，一般对材料进行预处理，例如通过光照、营 养等手段使微藻细胞分裂生长同步以及对材料进行较低温度的适应700 0/I II?sal 吕事S $111锻炼等，以提咼材料的抗冻能力。1 骨懂细胞(Medullary cd.Is)2 酵母细胞(Yeast crlLiX仓瓯红胞| HaniBtf1!1供11一叮4 红细胞Kry ill rocytc) 圏2儿

25、种堆胞的低温保你存活率 与冷却速率的关系big* -Rely ti oils hip betw r:iiviahi lity nf cold sin rage andcrwling rale of several kiiiih of cdls2.2抗冻保护剂到目前为止,除了最简单的细菌及多数其它类型微生物以外，绝大多数细胞的低温保存都必须采用抗冻剂。冰冻保护 剂的种类很多，一般可分为胞内保护剂和胞外保护剂两大类。胞内保 护剂属渗透型保护剂，属于小分子化合物，这类保护剂的特点是能很 快渗入细胞，占有细胞的容积，避免由于脱水过度而引起死亡。胞外保 护剂一般属于大分子化合物，它们不能渗入细胞，其作用是增加胞外 溶液粘性，减缓细胞脱水速度，从外环境避免细胞脱水过度引起的伤 害。由于单一保护剂各有优缺点，一般混合使用,使各种成分的保护作 用得到综合协调的发展，产生累加效应,又能彼此减少甚至消除单一 成分的毒害作用。2.3解冻方法解冻过程的关键是防止次级重结晶。现已证明，植物材料解冻时，次级重结晶的危险温度区约是-50-10C。一般建议, 如冷却过程的速率较快，那么相应的解冻速率也要快些，这样可获得 较好的效果。实践中，一般采用3740C的解冻速度。解冻后应立即 进行洗涤，清除冰冻保护剂，很快进行活力检查和再培养。