生物化学实验内容.docx

《生物化学实验内容.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验内容.docx（15页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、生物化学实验内容课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时开设实验项目数：8个适用对象：2017制药工程1、2班实验教师：段志芳一、实验目标及基本要求生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。二、 实验内容序号实验项目学时实验要求实验类别1植物组织中可溶性总糖的提取4必修验证性实验2蒽酮比色定糖法4必修验证性实验3卵磷脂的提取和鉴定4必修验证性实验4皂化价的测定4必修验证性实验5牛乳中酪蛋白的制备4必修验证性实验6蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝结合法）4必修验证性实验7酵母RNA的提取4必修验证性实验8R

2、NA的定量测定（苔黑酚法）4必修验证性实验三、 成绩包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。四、要求（1）实验过程中同组人可以配合进行；（2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3） 实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做；（4） 对实验结果进行简单的分析.实验一 植物组织中可溶性总糖的提取一、实验目的1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。3掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。二、实验原理可溶

3、性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。三、实验用品1. 仪器设备：电子

4、天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。2. 玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。3. 药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。4. 其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。四、实验操作取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入510ml

5、蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取23次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。五、实验结果与讨论1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。2、结合实验二结果计算含量六、实验注意事项（1） 若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。（2） 加热时应小心，避免灼伤皮肤。七、思考题1、可溶性糖在植物物质代谢中的作用。2、用水提取的糖类有哪些？实验二

6、蒽酮比色法测定可溶性总糖含量一、 实验目的1、 掌握蒽酮比色法测定可溶性总糖的原理和方法2、 掌握标准曲线的绘制3、 掌握分光光度计的使用方法二、实验原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应)，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。糖类与蒽酮反应生成的有

7、色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。三、实验材料、试剂与仪器设备1、仪器分光光度计（配玻璃比色皿、擦镜纸、注明废液回收的具塞广口瓶、洗瓶）；电子天平（配称量纸）；离心机（配离心管），恒温水浴锅。2、玻璃器皿0.5mL、1 mL、5 mL刻度吸管各2支（配合适大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度试管10支（应干净干燥，放到试管架上）；100 mL烧杯2个；10 mL量筒1个；玻璃棒1根；长胶头滴管1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。3、试剂：（1）（3）由实验员配制，贴好标签（1）80 %乙醇（2）葡萄糖标准溶液( 100 g/mL )：准确称取 100 mg 分

8、析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 1000 mL。（3）蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中) 1000 mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 3 周。（4）样品贮备液：学生实验一所得可溶性总糖提取物水溶液。 四、实验步骤1、标准曲线制作 取6支试管，从0 5分别编号，按下表加入各试剂：表 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量管 号012345100 g/mL 葡萄糖溶液( mL )00.20.40.60.81.0蒸馏水( mL )1.00.80.60.40.20蒽酮试剂( mL )5.05.05.0

9、5.05.05.0葡萄糖量( g )020406080100将各管快速摇动混匀后在沸水浴中煮 10 min，取出冷却，在 620 nm 波长下用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量( g )为横坐标绘制标准曲线。2、样品测定 将样品贮备液用蒸馏水稀释到合适范围，取该溶液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。 按照下式计算可溶性总糖的含量：w=nm1 V1V2 / m2100%式中：w-表示总糖含量n-稀释倍数m1-从标准曲线查得糖量, g .m2-样品重( g ).v1-提取物总体积（ml）v2-测定时样品体积（ml）五、结果与讨论：1绘制出

10、标准曲线2含量的计算六、实验注意事项（1）加浓H2SO4时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。（2）水浴加热时应打开试管塞。七、思考题1、植物组织中糖的测定方法还有哪些？举例说明其原理和优缺点？2、制作标准曲线时应注意哪些问题？实验三 卵磷脂的提取与鉴定一、 实验目的1、掌握磷脂类物质的结构和性质。2、掌握卵磷脂的提取鉴定的原理和方法。3、掌握乙醇做溶剂提取的操作技术。二、实验原理磷脂是生物体组织细胞的重要成分，主要存在于大豆等植物组织以及动物的肝、脑、脾、心等组织中，尤其在蛋黄中含量较多(10%左右)。卵磷脂和脑磷脂均溶于乙醚而不溶于丙酮，利用此

11、性质可将其与中性脂肪分离开；此外，卵磷脂能溶于乙醇而脑磷脂不溶，利用此性质又可将卵磷脂和脑磷脂分离。新提取的卵磷脂为白色，当与空气接触后，其所含不饱和脂肪酸会被氧化而使卵磷脂呈黄褐色。卵磷脂被碱水解后可分解为脂肪酸盐、甘油、胆碱和磷酸盐。甘油与硫酸氢钾共热，可生成具有特殊臭味的丙烯醛；磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵作用，生成黄色的磷钼酸沉淀；胆碱在碱的进一步作用下生成无色且具有氨和鱼腥气味的三甲胺。这样通过对分解产物的检验可以对卵磷脂进行鉴定。三、仪器和试剂1、仪器设备电子天平(精确到0.00g，配9cm称量纸)；减压蒸馏装置（旋转蒸 发仪+水循环真空泵+相应橡胶管，用前由实验员检查是否正常；配5

12、00mL24#磨口蒸馏和接收圆底烧瓶，2500mL磨口具塞广口瓶上标注回收乙醇，与仪器同台放置，提取时重复使用）。此部分共用。2、玻璃器皿回流装置一套（500mL 恒温磁力搅拌电热套(配2cm磁子)1台+250 mL24#磨口圆底烧瓶1个+24#磨口球形冷凝管1根+橡胶管2根+铁架台1个+铁夹2个）；过滤装置一套（铁架台1个+铁圈1个+玻璃漏斗1个+250 mL24#具塞磨口锥形瓶1个+18cm定性滤纸若干）；100 mL量筒各一个；100 mL烧杯一个；玻璃棒1根；长胶头滴管1个；长药勺1个；试管2支；蒸发皿1个。此部分为每组所用，放置各实验台上。3、药品试剂（3）由实验员配制，贴好标签。（

13、1）鸡蛋黄（2）95%乙醇（3）10%氢氧化钠溶液4、其它：红色石蕊试纸若干；剪刀2把；一次性手套若干；纸巾若干；标签纸若干。每个洗手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。四、操作步骤1、卵磷脂的提取 取250 mL24#磨口圆底烧瓶，放入2cm的磁力搅拌子，加入蛋黄20 g和95%乙醇60 mL，搅拌加热，稍冷后过滤到250 mL具塞磨口锥形瓶中，盖好塞子，滤渣同法提取23次，合并提取液，如滤液仍然混浊，可重新过滤直至完全透明。提取液减压蒸馏至少量，回收乙醇（放入回收瓶中），将剩余物用长胶头滴管转移置于蒸发皿内，水浴锅中蒸干，所得干物即为卵磷脂。称重并计算得率。2、卵磷脂的鉴定 取干燥试管一支，加

14、入少量提取的卵磷脂以及25mL 氢氧化钠溶液，放入水浴中加热15min，在管口放一片红色石蕊试纸，观察颜色有无变化，并嗅其气味。五、结果与分析1、观察产品的颜色外观2、计算产率3、鉴定结果六、思考题：1、卵磷脂的生物学功能有哪些？2、卵磷脂提取过程中，加入95%乙醇的作用是什么？实验四 脂肪皂化价的测定一、目的1、 掌握油脂的主要理化性质2、掌握油脂皂化价的测定原理和方法。3、掌握滴定分析法的操作二、原理脂肪的碱水解称皂化作用。皂化1g 脂肪所需的KOH 的毫克数称为皂化价。脂肪的皂化价与相对分子质量成反比，由皂化价的数值可知混合脂肪的平均相对分子质量。三、仪器、试剂和材料1、仪器设备：电子天

15、平(精确到0.000g，配5 ml称量瓶)。2、玻璃器皿：回流装置一套（500mL 恒温磁力搅拌电热套(配2cm磁子)1台+250 mL24#磨口圆底烧瓶1个+24#磨口球形冷凝管1根+橡胶管2根+铁架台1个+铁夹2个）；酸碱滴定管1支；50ml量筒1个；磨口具塞锥形瓶2只；100ml烧杯1只；玻棒1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。3、药品试剂：（2）（5）由实验员配制，贴好标签。（1）豆油（2）0.100mol/L 氢氧化钠乙醇溶液：以0.100mol/L标准盐酸溶液标定。（3）0.100mol/L标准盐酸溶液：取浓盐酸8.5ml ，加蒸馏水稀释至1000ml, 然后对此溶液进行标定。

16、（4）70%乙醇：取95%乙醇70 ml，加蒸馏水稀释至95ml。（5）1%酚酞指示剂：称取酚酞1g，溶于100ml 95%乙醇。四、操作步骤1. 在天平上称取脂肪0.5g 左右，置于250ml 圆底烧瓶中，加入0.1mol/LNaOH乙醇液50ml。装上冷凝管回流30-60min，至瓶内的脂肪完全皂化止（此时瓶内液体澄清并无油珠出现，若乙醇被蒸发，可酌情补充适量70%乙醇。2. 皂化完毕，冷至室温，加1%酚酞指示剂2滴，以0.1mol/LHCl液滴定剩余的碱（HCl 用量少可用微量滴定管），记录盐酸用量。另作一空白实验，除不加脂肪外，其余操作均同上，记录空白实验盐酸的用量。五、结果计算皂化价

17、=（a-b ）c56/Wa ：空白实验所消耗的HCl 的毫升数。 b：脂肪实验所消耗的HCl 的毫升数。 C：HCl的浓度，0.100mol/LW：脂肪的重量。56：KOH 的摩尔质量g/ ml。六、注意事项1、皂化所用试剂一定要标准，所用样品量要准确。2、实验过程应避免污染和干扰。七、思考题1. 什么是皂化价？它有何意义？2、如何检验油脂已皂化完全。实验五 牛奶中酪蛋白的制备一、目的与要求1、掌握从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法3、掌握离心、洗涤等实验操作技术二、原理蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋白质又是一种两性离子，

18、在一定pH溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。三、实验用品1、 仪器设备离心机（配10ml或15ml离心管），恒温水浴锅。2、 玻璃器皿50 mL烧杯1只，25mL烧

19、杯2只，10 mL具塞刻度试管1支，10mL量筒1支，玻璃棒1支，长胶头滴管2支。此部分为每组所用，放置各实验台上。3、 药品试剂：（2）（3）由实验员配制，贴好标签。（1）牛奶（2）0.2mol/L的pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液（3）0.2mol/L氢氧化钠溶液（4）冰醋酸（5）95%乙醇4、其它：精密pH试纸；一次性手套若干；纸巾若干；标签纸若干。每个洗手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。四、方法和步骤1、取预先放冰箱中冷却的消毒牛奶6mL，3 000r/min离心10min，除去脂肪层的乳液置50毫升烧杯内，加热至40左右，在搅拌下慢慢加入10mL左右预热的醋酸-醋酸钠缓冲液，用冰醋酸调节

20、pH=4.7，此时混浊液中有大量絮状物沉下。冷至室温，3000r/min离心10min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。2、用蒸馏水洗沉淀三次（每次5mL左右），3000r/min离心10min，弃去上清液。3、将沉淀加5mL 95%乙醇洗涤，离心后所得沉淀风干，得酪蛋白制品（称重，记录）。4、酪蛋白溶液的配制：称取酪蛋白0.01g，置25毫升烧杯中，加5mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液，搅匀， 隔水加热，溶解后转移至10毫升容量瓶中，用少量蒸馏 水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度处，摇匀，置冰箱中保存，实验六备用。五、结果与计算计算酪蛋白含量和得率：1、含量：酪蛋白克数/100mL牛

21、奶2、 式中理论含量3.5g/100mL牛奶六、注意事项1、离心机的使用安全：（1）使用前，离心管和离心物一定要对称平衡；（2）离心开始时，设置好了转速和时间，一定要等到转速稳定了后，人才能离开；（3）离心结束，只有仪器报警了，且转速完全为零后，才能打开离心机盖。七、思考题1、酪蛋白的理化性质2、酪蛋白的生物学功能有哪些？实验六 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度一、 目的 1、学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。2、掌握标准曲线定量分析方法 3、熟练掌握分光光度计的使用方法二、原理 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离

22、状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 三、材料、主要仪器和试剂 1仪器：分光光度计（配玻璃比色皿、擦镜纸、注明废液回收的具塞广口瓶、洗瓶）2. 玻璃器皿：0.1

23、mL、1 mL刻度吸管各2支（配合适大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度试管10支（应干净干燥，放到试管架上）；100 mL烧杯2个，10 mL量筒1个；玻璃棒1根；长胶头滴管1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。3试剂： （1）（3）由实验员配制，贴好标签。（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000gmL 的原液。 （2）考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 （3）0.9%Na

24、Cl（4）样品贮备液：实验五所得粗蛋白碱水溶液四、操作步骤 1标准曲线制作 （1）0100gmL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。 表1 低浓度标准曲线制作 （2）01 000gmL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为01 000gmL 的标准曲线。 表2 高浓度标准曲线制作 2样品提取液中蛋白质浓度的测定 （1）待测样品制备：将样品贮备液用0.9%NaCl合

25、适稀释至可测定范围，即得待测样品水溶液。 （2）测定：另取2 支10mL 具塞 试管 ，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595 nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（g）。以标准曲线1 号试管做空白。 五、结果计算 1绘制出标准曲线2含量的计算 式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（g）。 若样品溶液经过稀释，则最后结果要乘以稀释倍数。六、注意事项 1蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应

26、达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。 2. 制作标准曲线及测定样品时，要将各试管中溶液纵向倒转混合，目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。七、思考题 1 蛋白质浓度可以用哪些方法测定？参考答案：蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收、折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Folin酚试剂反应等方法来计算；也可以用染色法，如氨基黑、考马斯亮蓝法测定；还可以用荧光激发法、氰胺、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法。 实验七 酵

27、母RNA的提取一、实验目的：1、掌握RNA的理化性质2、掌握稀碱法提取RNA的原理与技术。二、实验原理：工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA达2.6710.0%，而DNA含量仅为0.030.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。结合实验八得到RNA浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出RNA含量。三、实验用品：

28、1仪器：电子天平（0.00g，配称量纸）；离心机（5000rmin-1，配离心管）；水浴锅或可控温加热设备2. 玻璃器皿100ml烧杯1个；10ml量筒3个；长胶头滴管3支；玻璃棒1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。3试剂：（2）由实验员配制，贴好标签。（1）干酵母粉（市售）（2）0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。（3）乙酸（AR）。（4）95%乙醇。4. 其它pH试纸（pH110）；滤纸；纸巾若干；标签纸若干。四、操作步骤：置1g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试

29、纸），离心1015分钟（4000rmin-1）。取上清液，加入95%乙醇8ml，边加边搅。加毕，静置，离心。用胶头滴管吸去上清液，沉淀再用95%乙醇洗2次（每次约2.5ml），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。沉淀即为粗RNA，将其用蒸馏水溶解后定容，贴好标签，保存至冰箱中，用于实验八。五、实验结果与讨论1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。2、结合实验八计算含量六、注意事项1、沉淀有时出现较慢，可多放置一些时间。七、思考题1、RNA的提取制备方法主要有哪些？参考答案：由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。

30、组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。实验八 苔黑酚法测定核酸含量一、 实验目的1、 掌握苔黑酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。2、 掌握标准曲线定量分析方法3、 熟练使用分光光度计二、实验原理 RNA含量测定除可用紫外吸收法及定磷法外，常用苔黑酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3,5-二羟基甲苯（苔黑酚，又名地衣酚orcinol）反应，在Fe 3+或Cu 2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670

31、nm处有最大吸收。RNA浓度在20250gml-1范围内，光吸收与RNA浓度成正比。三、实验用品1仪器分光光度计（配玻璃比色皿、擦镜纸、注明废液回收的具塞广口瓶、洗瓶）；水浴锅。2. 玻璃器皿1 mL、2 mL刻度吸管各2支（配合适大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度试管10支（应干净干燥，放到试管架上）；100 mL烧杯2个，10 mL量筒1个；玻璃棒1根；长胶头滴管1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。3试剂：（1）（2）由实验员配制，贴好标签。（1）RNA标准溶液：取酵母RNA纯品配成100微克/毫升的溶液。配制时先用蒸馏水溶解，若不溶可滴加浓氨水，调pH=7.0，再定容。（2）苔黑酚试

32、剂：先配0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶剂配制0.1%苔黑酚溶液，临用时配制。（3）样品待测液：由实验七所得，用时根据需要进行稀释。四、操作步骤：1标准曲线的制作 取6支干净烘干试管，按下表编号及加入试剂。表 制作标准曲线的试剂量管 号012345RNA标准液( mL )00.40.81.21.62.0蒸馏水( mL )2.01.61.20.80.40苔黑酚试剂( mL )2.02.02.02.02.02.0核酸量( g )04080120160200加毕混匀，置沸水浴加热45min，取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。以RNA量为横坐标，光吸

33、收为纵坐标作图，绘制标准曲线。2样品的测定取两支试管，各加入2.0ml样品液，再加2.0ml苔黑酚试剂。如前述1进行测定。根据标准曲线求得RNA含量：w=m1 V1V2 / m2100%式中：w-表示RNA含量m1-从标准曲线查得RNA量, g .m2-样品重( g ).v1-提取物总体积（ml）v2-测定时样品体积（ml）若样品溶液经过稀释，则最后结果要乘以稀释倍数。五、结果与讨论：1绘制出标准曲线2RNA含量的计算六、注意事项（1）样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。（2）本法特异性较差，凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时，亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl22H2O可减少DNA的干扰，甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。此外，利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同，且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后，DNA在600nm呈现最大光吸收，而RNA则在反应15min后，在670nm下呈现最大光吸收。七、思考题1、测定核酸含量的常用方法有哪些？优缺点如何？ 15