杯碟法检测方法090626

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1、杯碟法检测青霉素酶的方法（试行）1. 适用范围 本方法适用于原料奶、灭菌乳、乳饮料中青霉素酶的检测。2. 实验原理 青霉素酶能够破坏青霉素对藤黄微球菌的抑制作用，而舒巴坦能特异性地抑制青 霉素酶的这种作用，在样品中先后加入适量的舒巴坦和青霉素，采用杯碟法通过测定 抑菌圈大小差异来检测样品中的青霉素酶。酶活单位（Active Unit）：在室温（25C ）下，lmin分解1“ mol的青霉素G所 需的酶量为一个单位，即 1IU。3. 试剂与材料除另有规定外，所有试剂为分析纯，水为GB/T6682-2008规定的三级水。3.1 菌种：藤黄微球菌（ Micrococcus Luteus） ,菌种号

2、CMCC（ B） 28001。3.2青霉素酶标准品：纯度$90%,酶活1200IU/mg（$1000万青霉素效价单位），4C 保存。3.3舒巴坦标准品：纯度89.2%, 4C保存。3.4青霉素G：色谱级，纯度97% （分析纯需适当增加标准工作溶液浓度），密封避光, 防潮，4C保存。3.5磷酸二氢钾（KHPO ）：纯度99.5%。243.6 磷酸氢二钾（ K HPO ）：纯度 98%。243.7 氯化钠（NaCL）：纯度 99.5%。3.8磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）：取8g磷酸二氢钾（3.5）和2g磷酸氢二钾（3.6）, 用1000ml水溶解，121C高压灭菌15min。3.9生理盐水：称取8

3、.5g氯化钠（3.7），溶解于1000ml水中，121C高压灭菌15min。3.10青霉素酶标准储备溶液：准确称取（精确至0.001g）青霉素酶标准品（3.2）用生理盐水（3.9）溶解并稀释，配成酶活力为1000IU/ml的标准储备溶液，4C保存。 可使用 1 个月。3.11 青霉素酶标准工作液：用生理盐水（3.9）将青霉素酶标准储备溶液（3.10）稀 释配制成酶活力为 1IU/ml 的标准工作溶液，需当天配制使用。3.12舒巴坦标准储备溶液：准确称取（精确至O.OOlg）舒巴坦标准品（3.3）,用磷 酸盐缓冲液（3.8）溶解并定容为10mg/ml。4T保存。可使用1-2个月。3.13 舒巴坦

4、标准工作溶液：用磷酸盐缓冲溶液（3.8）将舒巴坦标准储备溶液（3.12） 稀释配制成浓度为1mg/ml，需当天配制使用。3.14青霉素G标准储备溶液：准确称取（精确至O.OOlg）青霉素G（3.4），用磷酸 盐缓冲溶液（3.8）溶解并定容为1mg/ml,4C棕色瓶中保存，可使用1-2个月3.15青霉素G标准工作液：取青霉素G标准储备液（3.14）,用磷酸盐缓冲液（3.8） 稀释，配制成浓度为10p g/ml, 4C保存。可使用2-3天。3.16 空白奶粉：脱脂奶粉3.17灭菌脱脂乳：使用脱脂奶粉（3.16） 按 GB/T4789.27-2008中4.2执行（10g奶 粉+90ml 水，113C

5、灭菌 20min）。3.18菌种培养基：LB营养琼脂3.19抗生素I号培养基4. 仪器与设备4.1天平：精确到0.001g4.2 冰箱： 4C4.3 恒温培养箱： 36C1C4.4 恒温水浴锅： 55C1C4.5 恒温干燥箱4.6 高压灭菌锅4.7 抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺（精确到 O.1mm）4.8 旋涡混匀器4.9 移液枪：20-2001、100-10001、1000-5000l4.10培养皿：内径900.5mm，皿底平整光滑，厚薄均匀无凹凸现象。4.11牛津杯：不锈钢管，外径（7.80.1mm），内径（6.00.1mm）,高度（10.0土 0.1mm）。4.12陶瓦盖：内径110m

6、m，外径116mm，高度26mm。5. 检测步骤5.1 试样制备5.1.1液体奶：取奶样25g，混合均匀，待处理。5.1.2酸奶：取酸乳样品25g，经生理盐水1：1稀释，混合均匀，待处理。5.1.3 阴性对照样品：灭菌脱脂乳 5.1.4阳性对照样品：移取青霉素酶标准工作液加入到灭菌脱脂乳中，混合均匀配制 成酶活力为0.1IU/ml的阳性对照样品，4C保存。可使用2-3天。5.2 试样处理5.2.1取试样900l分别放入A、B、C、D四个2ml离心管中，加入以下配置（加样 顺序按试剂排列顺序）：A：加50l舒巴坦标准工作溶液，再加入50l青霉素G标准工作溶液。氏加50l舒巴坦标准工作溶液，再加入

7、50l磷酸盐缓冲液。C：加100l磷酸盐缓冲液。D：加50l青霉素G标准工作溶液，再加入50l磷酸盐缓冲液。 将上述混合液用涡旋混匀器充分振荡混匀，室温放置 1 小时后检测。 同时做阴性对照和阳性对照样品各一组。5.3 菌悬液的制备及用量将菌种接种于菌种培养基斜面试管中（工作菌株正常使用传代数为 3-10 代，一 般可使用1-2个月），361C培养22-24h。使用4ml生理盐水将经过培养的新鲜斜 面培养物洗下，混合均匀，得到菌悬液（含菌量大约1* 109CFU/ml）。将菌悬液以2% 的比例加入到 LB 营养琼脂中，菌悬液中含菌量的多少，以能使 0.5 g/ml 的青霉素 G工作液产生约22

8、mm清晰、完整的抑菌圈为宜。5.4 检测用平板的制备在无菌平皿中注入抗生素I号培养基10-15ml，作为基础培养基，放置在水平台 面上，将皿盖倾斜在一侧，待其自然凝固后将皿盖盖好备用。将灭菌的菌种培养基溶化后在水浴锅中冷却至 55 C左右，加入适量的菌悬液 （5.3）混匀，移取 5ml 注入铺有基层培养基的培养皿中，迅速均匀的摊开，放置在 水平台面上凝固，在每个培养基表面均匀对称放置4个牛津杯后待用。加完培养基后一定要放置水平，制作过程中要防止污染，加抗生素I号培养基后 注意冷凝水的控制。检测用平板需当天使用当天制作，且保证是同一批次。5.5 试样测定取A、B、C、D四个离心管中的试液各200

9、L分别加入到检测平板的四个牛津 杯中，每组试验至少做三平行，将陶瓦盖盖好，培养皿水平放置于361C培养箱中 培养22h-24h。培养结束后去除陶瓦盖和牛津杯后待结果报告。5.6 结果判定使用抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺分别精确测量 A、B、C、D 各抑菌圈直径； 当B和C相等或者差异在1mm之内时，实验的重复性良好，可以继续报告结果；当A 直径-D直径V3mm时，判定样品中的青霉素酶结果为阴性；A直径-D直径$3mm时， 判定样品中的青霉素酶结果为阳性。如果阴性对照和阳性对照的结果均符合上述条件。但样品测定的培养皿中所有 牛津杯均未出现抑菌圈（尤其是A圈和D圈）。应使用生理盐水将样品做适当稀

10、释后 再进行测定，直到培养皿中出现大于10mm清晰、完整的抑菌圈为止。6. 注意事项6.1 药品配制6.1.1 在配制储备液和工作液时，一定要正确识别所购药品的纯度和其所标识的单 位，然后根据所配储备液和工作液要求的浓度和单位，进行准确配制。6.1.2用于配制药品的容器如不能高压灭菌，需用 75%酒精进行2-3次的消毒，再用 所使用的无菌溶剂（生理盐水、磷酸盐缓冲溶液）进行2-3次的润洗后再进行药品的 配制。6.1.3配制好的工作液最好存放于无菌容器中，4T下避光保存，临用前，将所使用 工作液部分的转移到无菌容器（离心管、试管等）中使用，防止吸样过程中对试剂造 成污染。6.1.4每次在新旧试剂

11、更换前，均需先做对照试验，在对照试验符合要求后再更换。6.2 菌悬液制作6.2.1 藤黄微球菌复苏和传代注意事项见附录 16.2.2 用于洗培养斜面上菌种的生理盐水的温度至少要达到室温状态。6.2.3倒入的LB营养琼脂的温度要求控制在40-50之间，防止因温度太低导致平板 制作不够水平，温度太高将菌种灭活或变异。6.2.4将已经加入菌悬液的LB培养基混匀后，迅速的转移到加有抗生素I号培养基 的平皿中，不要在水浴锅中长时间放置，导致菌种的失活或变异。6.2.5 根据所传代菌种量的多少和使用时间，可适当增加或减少生理盐水的量，保证 平板中的菌量和青霉素的量达到最佳配比，使检测后的抑菌圈控制在17-

12、27mm之间。6.3 检测平板的制作6.3.1加完培养基后的平板要求水平放置，制作过程中要防止污染，加抗生素I号培 养基后注意冷凝水的控制。6.3.2 放入牛津杯前，要先识别所用平板是否水平，是否会对试验有影响。6.3.3 检测用平板要求当天使用当天制作，且保证是同一批次。6.4 试样处理和测定6.4.1 所检测样品在使用前要求充分混匀，避免检测结果偏差太大。6.4.2 每次试验必须做阴阳性对照。6.4.3 如果所检测样品的粘稠度或浓度太大，可根据产品性质做适当的稀释后再进行 检测。6.4.4 在试样处理和检测过程中，要求加样量和加药量必须准确，保证检测结果的可 参考性。6.4.5在每个900

13、ul的样品（A、B、C、D）中加入药品时，必须按照方法中的顺序逐 个加入（如舒巴坦和青霉素不可以颠倒加入）。6.4.6 放置牛津杯时，必须均匀对称的放置，以免各自产生的抑菌圈有交叉或贴壁现 象。6.4.7 将处理好的样品加入牛津杯时，注意枪头与牛津杯不要碰撞，使加入的样品从 杯底渗流，影响最终结果判定。6.4.8 在培养过程中，要保持平皿水平，放置因牛津杯位置不够水平，影响最终结果 判定。6.5 结果报告6.5.1 在进行结果报告前，一定要识别试验现象是否正常，如阴阳性对照试验是否符 合要求、抑菌圈的大小是否符合试验规定、抑菌圈是否是圆的、是否有交叉、平皿是 否有污染等。6.5.2如果B、C抑

14、菌圈超出实验重复性范围，则结果不能报告。6.5.3 如果试验中 A、 B、 C、 D 都未出现抑菌圈，则需将样品做适当稀释后再检测， 如果试样中 A、 B、 C、 D 都出现抑菌圈，且抑菌圈的大小基本一致，是样品自身含有 抑菌物质。质管部中心化验室2009年6月29日附录1：藤黄微球菌复苏和传代注意事项因藤黄微球菌容易变异且培养时间长，所以在进行复苏或传代时，必须严格执行无菌操作，防止对菌种的污染和变异，具体操作流程图如下：备注：3-10 代的传代方式依次类推，肉汤和斜面复苏根据菌种生长情况可自行选择。 具体操作说明：1、藤黄微球菌在进行复苏时，首先在固体菌种中加入30-40r的肉汤0.3-0

15、.8ml,然 后采用液体培养和固体斜面培养两种方式进行菌种的复苏，其中液体培养是将溶解好 的菌种少量加入到5ml肉汤中进行培养，固体斜面培养是用接种环挑取适量的溶解好 的菌种进行斜面划线。2、接种用斜面的制作：最好选用18*180mm的试管，LB培养基斜面制作见下图，即 从试管底到距试管底部大约15mm左右的距离充满培养基，从15mm左右开始制作大 约 40-50mm 的斜面。斜面不要求太长，否则在接种过程中与接种环容易交叉，导致3、接种过程中接种环每次灼烧后必须待整个接种环（包括灼烧过的“杆”的部分） 均彻底冷却后，方可进行后续的步骤。4、进行斜面接种划线时，菌量选择要适中（划1-2 次即可），因菌量的多少直接影响 到菌悬液的制作和抑菌圈的大小。5、藤黄微球菌在进行复苏和传代时，一般要求在37C培养22-24小时，如果菌种在 此条件下未生长或生长状况不好，可继续延长培养 72 小时，如生长状况仍不佳，即 不能使用。6、菌种在传代或保存过程中，要求试管始终处于直立状态，以免底部的冷凝水倒流 影响菌种的生长和储存。7、菌种正常使用的是3-10代，使用期限是1-2 个月，所以根据使用情况，在传代过 程中可以接种多个试管，以备使用。