血红蛋白的提取和分离课件新人教版选修1

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1、12血血每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。呈红色。3 凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理4 大多数凝胶是由多大多数凝胶是由多糖类化合物糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多

2、孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，利用具有小，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行分离。的凝胶，来进行分离。当当相对分子量不同相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。道，只能在凝胶外部移动，路程较短

3、，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。5分离蛋白质分离蛋白质6 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或外加少量强酸或强碱强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混合溶液。不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，维持值的影响，维持PHPH基本不变。基本不变。通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内

4、使用的缓冲液使用的缓冲液。,利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察正常结构和功能，便于观察()和科学研究和科学研究()磷酸缓冲液磷酸缓冲液7带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

5、电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。8 9 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-亚甲

6、基双丙亚甲基双丙烯酰胺在烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。具有三维网状结构的凝胶。N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应应10 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。（为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。由

7、几条肽链组成由几条肽链组成的的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩。因而掩盖了盖了，使电泳迁移率完使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。11用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法12样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用

8、猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）同沉淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化钠溶液洗涤。的氯化钠溶液洗涤。5

9、 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。明洗涤干净。13 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟（加速细胞破裂）分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离将搅拌好混合液转移到离心管内，以心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 10 minmin。第第1 1层（最上层（最上层）：甲苯层

10、（层）：甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层层（中上层中上层）：脂溶性物质沉淀层（）：脂溶性物质沉淀层（白色白色薄层固体）；薄层固体）；第第3 3层（中下层）：血红层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红暗红色色）。）。用滤纸过滤，除去脂溶用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的分出下层的红色透明液体。红色透明液体。1415 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放

11、入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液中（磷酸缓冲液中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。1617 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖覆盖尼龙网，再用尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则底

12、塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应将上述三者按相应位置组装成一个整体位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。18A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。B B、代表意义、代表意义：“G”G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时

13、吸水时吸水7.57.5克。克。配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。悬浮液。A A、固定：、固定：将色谱柱装置固将色谱柱装置固定在支架上。定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：

14、、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。19装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时。小时。1 1、液面不要低、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质流动与最终生物大分子物质的分离效果。的分离

15、效果。2 2、不能发生洗、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的脱液流干，露出凝胶颗粒的现象现象。20打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。加样后打开下端出口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入小心加入pH=7.

16、0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管

17、口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。21正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。22让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能正常。范围内，维持结构和功能正常。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。直观，大大

18、简化了实验操作。23 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：。首先通过洗涤红细胞、血红蛋首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，血红蛋白溶液，即即:样品的处理；样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后将相对分子质量较大的将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，杂质蛋白除去，即即:样品样品的纯化；最后经的纯化；最后经进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。24鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。3.3.方法步骤：（略）方法步骤：（略）25

19、观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2

20、 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝

21、胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。26 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。27凝胶色谱法的原理和方法

22、凝胶色谱法的原理和方法 样品的处理样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2829血血每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。呈红色。30选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质

23、和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质。的蛋白质。3132教学反馈教学反馈 1凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小分子的大小 B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C带电荷的多少带电荷的多少 D溶解度溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（维持（）基本不变。）基本不变。A温度温度 B pH C渗透压渗透压 D氧气浓度氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷电泳是指带电

24、粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。）的电极移动。A相同相同 B相反相反 C相对相对 D相向相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的）与氧气的运输有关。运输有关。A血红蛋白血红蛋白 B肌红蛋白肌红蛋白 C肌动蛋白肌动蛋白 D肌球蛋白肌球蛋白BBBA335血液由血浆和各种血细胞组成，其中（血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。的含量最多。A白细胞白细胞 B血小板血小板 C红细胞红细胞 D淋巴细胞淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（凝血剂（）。）。A.NaCl B.甲苯甲苯 C.蒸馏水蒸馏水 D.柠檬酸钠柠檬酸钠7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为可以明显看到试管中的溶液分为4层，层，其中第其中第3层是（层是（）A无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物其他杂质的暗红色沉淀物CDC